李庭樹 莫仁高 雷智冬 黃鎖義

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2臨床醫(yī)學(xué)院；3廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；右江民族醫(yī)學(xué)院 4藥學(xué)院；5科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

雞骨草又名黃頭草、黃仔強(qiáng)、大黃草、豬腰草，為豆科Leguminosae，該植物主要分布于廣東、廣西等地。雞骨草全草除其種子外均可入藥，具有利濕退黃，清熱解毒，疏肝止痛等功效〔1，2〕，雞骨草是一種藥食兩用植物，在春夏潮濕季節(jié)用來煲湯及制作涼茶等〔3〕。雞骨草藥理作用是多方面的，它涉及降脂保肝〔4，5〕、抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫、抗氧化〔6～8〕、促進(jìn)傷口愈合、治療母兒ABO血型〔9〕不合等多種生物活性。在前期試驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)雞骨草醇提取物對小鼠肝癌 H22荷瘤小鼠有一定的抗腫瘤作用〔10〕。本文旨在探討雞骨草體外抗腫瘤活性及確定其活性部位。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 雞骨草購自廣西百色市(經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)學(xué)教研室覃道光副教授鑒定為豆科相思子屬植物廣東相思子的全草)；細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人肝癌細(xì)胞株BEL-7404和人乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)；RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技公司)；優(yōu)級胎牛血清(AusGeneX)；無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)、CCK-8試劑(博士德)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；0.25% EDTA-胰酶(北京索來寶公司);Hoeshst33258染色液(凱基生物)；碘化丙啶(PI)染色試劑盒〔生工生物(上海) 有限公司〕；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等其他試劑均為分析純。

RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B88 型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；真空干燥箱(DZF-6020 型，廣州市星爍儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海力康HF90)；多功能酶標(biāo)儀(德國伯托 Tri Star LB941)；電子天平(FA1204B 型，上海天美天平儀器有限公司)；ALPHA1-2/LD-Puls冷凍干燥機(jī)(德國CHRIST)；倒置熒光顯微鏡為尼康公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2雞骨草提取物的制備 取雞骨草全草干燥粉末用95%乙醇進(jìn)行加熱回流提取，過濾，濃縮至膏狀即得雞骨草的乙醇粗提取物。將乙醇粗提取物溶于水中形成混懸液，分別用石油醚、乙酸乙酯與正丁醇依次萃取，回收萃取溶劑繼而得到石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏和水層部位浸膏。最后將浸膏粉制成凍干粉，準(zhǔn)確稱取雞骨草4個不同部位，用1% DMSO溶液溶解，配成相應(yīng)濃度的母液的浸膏，0.22 μm過濾，分裝存儲。4℃冰箱保存，使用時以完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.3雞骨草提取物體外抗腫瘤作用

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) BEL-7404細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞在RPMI1640培養(yǎng)基，MCF-7細(xì)胞在 DMEM 培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清，青霉素，鏈霉素各 100 U/ml) 中，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，每天更換一次培養(yǎng)基，每2 d傳代一次。

1.3.2CCK-8檢測 取對數(shù)生長的BEL-7404細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞以5 000個/每孔的密度接種于 96 孔板內(nèi)于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將雞骨草4 種萃取部位經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后，用DMSO梯度稀釋，每孔細(xì)胞加入10 μl使其在每孔的終濃度為 10、20、40、60、80 mg/ml，每個濃度組各設(shè) 5 個復(fù)孔，于加藥培養(yǎng) 24 h 后每孔加入10 μl CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 1 h，取出于 450 nm檢測吸光度。

1.3.3形態(tài)學(xué)觀察 將BEL-7404細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞以 1 萬個/每孔的細(xì)胞密度接種于 6孔板中，24 h后加入200 μl濃度為60 mg/ml的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位處理24 h 后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.4Hoechst33258染色檢測BEL-7404細(xì)胞凋亡 取處于對數(shù)生長期的BEL-7404細(xì)胞，接種于 6 孔培養(yǎng)板，每孔加入20×105個細(xì)胞。設(shè)對照組和不同濃度的給藥組，細(xì)胞貼壁后，加入濃度為20、40、60 mg/ml的乙酸乙酯萃取物。藥物作用24 h 后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，每孔加入1 ml的4%甲醛固定液，于4℃冰箱中固定30 min，取出PBS洗3次，加500 ml Hoechst33258染液，在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。用PBS 清洗3次，在激發(fā)波長 350 nm，發(fā)射波長 460 nm的熒光顯微鏡下隨機(jī)拍照。

1.3.5流式細(xì)胞儀檢測雞骨草乙酸乙酯萃取部位對BEL-7404細(xì)胞周期的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個/每孔的密度接種于 6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，加入200 μl不同濃度乙酸乙酯萃取物(20.0、40.0、60.0 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞用70%預(yù)冷乙醇固定，4℃避光過夜，用預(yù)冷 PBS洗兩遍，加入碘化丙啶(PI)避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測，分析各組樣本 DNA 含量及周期變化。

1.3.6膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/PI檢測雞骨草乙酸乙酯提取物對BEL-7404腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞以 1×106個/每孔的密度接種于 6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，加入200 μl不同濃度乙酸乙酯萃取物(20.0，40.0，60.0 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，用0.25%胰酶消化離心，加入1×結(jié)合緩沖液配置成濃度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液，吸取100 μl細(xì)胞懸液于EP管中，分別加入5 μl FITC和PI常溫避光混勻孵育15 min，加400 μl 1×結(jié)合緩沖液，并于1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.4數(shù)據(jù)處理 采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1雞骨草提取物對四種細(xì)胞增殖的影響 與對照組(濃度為0 mg/ml)相比，作用 24 h 后，石油醚部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位對BEL-7404細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用且呈濃度依賴關(guān)系。從表1可以看出，乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位抗腫瘤活性較強(qiáng)。經(jīng)擬合計(jì)算，石油醚萃取部位作用BEL-7404細(xì)胞、SGC-7901胃癌細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞后的 IC50值為7 788.0、390.0、610.5 mg/ml，乙酸乙酯萃取部位的 IC50值為40.72、46.74、39.87 mg/ml。正丁醇萃取部位的 IC50值為66.06、68.41、46.36 mg/ml。水萃取部位的 IC50值為63.91、74.99、80.96 mg/ml。

2.2雞骨草提取物對腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，可見陰性對照組的BEL-7404、SGC-7901、MCF-7 細(xì)胞貼壁生長，大小均勻，胞質(zhì)透亮，折光性好，增殖旺盛。3種腫瘤細(xì)胞經(jīng)濃度為60 mg/ml的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位給藥處理 24 h后，均顯著改變了細(xì)胞形態(tài)，表現(xiàn)為細(xì)胞密度明顯減小，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間距變大，貼壁作用減弱。石油醚部位和陰性對照組對3種細(xì)胞株密度影響不明顯，形態(tài)上石油部位和陰性對照組3種細(xì)胞形態(tài)幾乎沒有變化。見圖1。

表1 不同濃度雞骨草各部位提取液對SCG-7901、BEL-7404、MCF-7細(xì)胞增殖的影響(抑制率，

圖1 雞骨草不同提取部位對 3種腫瘤細(xì)胞株形態(tài)的影響(×200)

2.3雞骨草不同提取部位對腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 陰性對照組細(xì)胞飽滿，胞質(zhì)豐富，胞核圓形或橢圓形，染色質(zhì)熒光著色均勻。加藥組明顯看到細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核體積變小、皺縮，可見致密濃染熒光，染色體 DNA呈濃染的團(tuán)塊狀、顆粒狀分布，提示出現(xiàn)了明顯的凋亡特征，且凋亡細(xì)胞數(shù)目隨著藥物濃度的增加而增加，見圖2。

2.4雞骨草不同濃度乙酸乙酯萃取部位對BEL-7404細(xì)胞周期分布的影響 與陰性對照組比較，不同濃度雞骨草乙酸乙酯萃取部位可明顯增加肝癌BEL-7404細(xì)胞G0/G1期比例，明顯降低S期及G2/M期比例，能誘導(dǎo)肝癌BEL-7404細(xì)胞發(fā)生凋亡并呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01)，見表2。

2.5雞骨草乙酸乙酯萃取部位對BEL-7404細(xì)胞凋亡率的影響 以細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡和計(jì)算細(xì)胞平均凋亡率，各濃度雞骨草乙酸乙酯萃取物作用于 BEL-7404細(xì)胞24 h后，與陰性對照組(1.76%)相比細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度(20、40、60 mg/ml)的加大而增大(14.66%，39.30%、59.40%，P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖2 Hoechst33258熒光染色法觀察雞骨草乙酸乙酯部位對BEL-7404細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響(×200)

表2 雞骨草乙酸乙酯萃取部位對BEL-7404肝癌細(xì)胞周期的影響

圖3 雞骨草乙酸乙酯萃取部位對BEL-7404細(xì)胞凋亡率的影響

3 討 論

植物藥具有較為顯著的療效和較小的不良反應(yīng)等特點(diǎn),在用于癌癥治療的藥物中，植物藥占比越來越大。我國有豐富的藥用植物種質(zhì)資源，篩選和分離中藥抗癌活性成分，闡明其抗癌作用和機(jī)制，對抗癌藥物的研究和開發(fā)及癌癥治療具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：雞骨草乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水萃取部位對 BEL-7404 細(xì)胞、 SGC-7901 胃癌細(xì)胞、MCF-7 乳腺癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用且呈濃度依賴關(guān)系，以乙酸乙酯萃取部位抗腫瘤活性最強(qiáng)。Hoechst33258 熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：雞骨草乙酸乙酯萃取部位可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度成正比。在后續(xù)的研究中以雞骨草乙酸乙酯萃取部位為研究對象，對其進(jìn)一步提取分離。本實(shí)驗(yàn)為雞骨草用于臨床治療癌癥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ),為后期分離雞骨草具有抗腫瘤作用的單體化合物指明方向，但雞骨草抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。