劉丹輝 齊博 劉玉珍 陳智 趙寶生

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 衛(wèi)輝 453100；2食管癌研究所；3第一附屬醫(yī)院生命科學(xué)研究中心)

食管癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，主要分鱗癌與腺癌兩大病理類型，在中國(guó)90%以上為食管鱗癌患者〔1〕。盡管目前對(duì)于食管癌的診療已經(jīng)有了顯著進(jìn)步，如手術(shù)、化療、放療等，但由于高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特性，其預(yù)后依然很差。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)作為絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)分子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔2〕。ERK通過(guò)活化核因子κB等途徑誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白的降解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡；絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)作為ERK的激酶，引起ERK磷酸化的發(fā)生。應(yīng)用MEK抑制劑抑制ERK磷酸化(磷酸化ERK為ERK活化形式)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與周期阻滯，對(duì)不同類型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出抑制生長(zhǎng)、促進(jìn)凋亡的作用〔3～5〕。在腫瘤遷移及侵襲方面，ERK通過(guò)活化轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白(AP)-1等促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，利于腫瘤細(xì)胞的遷移，抑制ERK活性后腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著被抑制〔6〕。然而，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑治療某些腫瘤并不能提高患者5年生存率，且有研究報(bào)道MEK抑制劑具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移的作用〔7〕。目前有關(guān)MEK抑制劑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移的影響及其作用機(jī)制，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在分析MEK抑制劑U0126對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 人食管癌細(xì)胞系KYSE-150購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，使用RPMI1640(含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液)培養(yǎng)細(xì)胞。MEK抑制劑U0126購(gòu)自美國(guó)APExBIO公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天公司，放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購(gòu)自博士德公司，Transwell小室購(gòu)于美國(guó) Corning 公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(1∶8 000)，磷酸化(p)-ERK1/2、E-鈣黏蛋白(cadherin)、β-連環(huán)蛋白(catenin，1∶1 000)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，GADPH(1∶1 000)抗體購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) KYSE-150細(xì)胞，使細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，每3 d傳代一次。 U0126處理KYSE-150細(xì)胞，使其終濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L。

1.3Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞垂直遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清的培養(yǎng)基RPMI1640重懸細(xì)胞(濃度為5.0×105/ml)，取200 μl(含細(xì)胞數(shù)1.0 × 105個(gè))加入Transwell上室中，在下室加入600 μl含10% 胎牛血清培養(yǎng)基，將小室放入培養(yǎng)板中。分為0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L的 U0126組，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%的結(jié)晶紫對(duì)下室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽除去上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞。最后顯微鏡下觀察細(xì)胞，取9個(gè)不同視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞水平遷移能力 將細(xì)胞密度為5.0×105/ml 的細(xì)胞懸液加入6孔板中，在37℃含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)不同濃度U0126處理，在細(xì)胞上用200 μl 的槍頭劃?rùn)M線三條繼續(xù)培養(yǎng)。藥物分別處理24 h、48 h后取出細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞橫向遷移情況，并在相同位置拍照。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn) 分別收集0.0、0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白。按每孔20 μg蛋白制備蛋白樣品、上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。經(jīng)5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h后，加入相應(yīng)的一抗稀釋液，4℃ 孵育過(guò)夜?；厥找豢?，TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗，室溫孵育70 min，TBST清洗3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影，采用凝膠成像設(shè)備觀察結(jié)果并拍照，用ImagegJ 18.0圖像分析軟件測(cè)條帶灰度值并比較各組間差異。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism7軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1U0126對(duì)食管鱗癌細(xì)胞垂直遷移的影響 0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理組的細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)〔(83.33±9.00)個(gè)、(240.00±2.49)個(gè)、(314.00±2.94)個(gè)〕較0.0 μmol/L U0126(對(duì)照)組〔(115.00±7.12)個(gè)〕明顯增加，且處理組穿膜細(xì)胞數(shù)目隨U0126濃度的增高而增加(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞垂直遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.2U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞水平遷移的影響 U0126促進(jìn)KYSE-150細(xì)胞遷移，且隨著U0126濃度及時(shí)間的增加，促進(jìn)效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理細(xì)胞24、48 h后橫向遷移細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組除0.5 μmol/L 24 h時(shí)外，其余差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1和圖2。

表1 U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞水平遷移的影響個(gè)，n=3)

圖2 U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞水平遷移的影響(×200)

2.3U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 0.5、1.0、2.5 μmol/L U0126處理組 E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，而 β-catenin蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，0.5、1.0 μmol/L U0126與p-ERK1/2表達(dá)較對(duì)照組無(wú)明顯改變，但2.5 μmol/L U0126抑制p-ERK1/2表達(dá)(P<0.01)。見(jiàn)圖3和表2。

1～4：對(duì)照組，0.5 μmol/L U0126組，1.0 μmol/L U0126組，2.5 μmol/L U0126組圖3 U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表2 U0126對(duì)KYSE-150細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的 影響

3 討 論

食管癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高，且預(yù)后差，是世界上最常見(jiàn)的第8大惡性腫瘤，中國(guó)90%以上為食管鱗癌患者〔8〕。由于食管癌具有高度侵襲性且易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，其5年生存率不到20%。盡管許多抗腫瘤藥物能抑制食管癌的進(jìn)展，但有些患者治療效果依然很差，其原因有待進(jìn)一步闡明。Ras/MEK/ERK通路對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等方面起著關(guān)鍵作用〔9～16〕。因此，ERK被認(rèn)為是治療癌癥的合適靶點(diǎn)〔17〕。ERK活化促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡，針對(duì)調(diào)控ERK的上游激酶的抑制劑，已被研發(fā)應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。通過(guò)應(yīng)用ERK激酶MEK抑制劑進(jìn)而抑制ERK信號(hào)通路，抑制ERK磷酸化的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，鈣結(jié)合蛋白S100A12上調(diào)前列腺癌細(xì)胞ERK磷酸化水平，具有明顯抗凋亡能力，MEK抑制劑MK-8353明顯逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象的發(fā)生〔18〕。此外，ERK磷酸化可通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，利于EMT現(xiàn)象的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。EMT即上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通過(guò)修飾細(xì)胞表達(dá)的黏附分子，從而使其具有遷移和侵襲行為。上皮標(biāo)志物E-cadherin和間充質(zhì)標(biāo)記物β-catenin、vimentin等均為EMT的標(biāo)志蛋白，上皮標(biāo)志物的下調(diào)與間充質(zhì)標(biāo)志物的上調(diào)預(yù)示著腫瘤細(xì)胞EMT現(xiàn)象的發(fā)生。Zheng等〔19〕研究證實(shí)鈣蛋白酶家族成員Capn4通過(guò)ERK/c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化激活A(yù)P-1，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞遷移。ERK磷酸化水平上調(diào)，促使胰腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，抑制ERK磷酸化水平上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)vimentin的表達(dá)，降低胰腺癌細(xì)胞的遷移能力〔20〕。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)MEK抑制劑PD98059通過(guò)EGFR信號(hào)的激活刺激β-catenin核積聚進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移〔7〕。

已有文獻(xiàn)報(bào)道10 μmol/L U0126對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖無(wú)影響，但隨著濃度的增加，其對(duì)食管鱗癌的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)〔21〕。前期通過(guò)對(duì)不同食管鱗癌細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，U0126小于10 μmol/L對(duì)KYSE-450、EC9706細(xì)胞的遷移均無(wú)影響，但卻明顯促進(jìn)KYSE-150細(xì)胞遷移。因此本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MEK1/2抑制劑U0126以時(shí)間-劑量依賴性的方式抑制食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的遷移。

β-catenin通常作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移〔22〕。β-catenin可通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在內(nèi)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)〔23〕。雖然β-catenin高表達(dá)發(fā)生在應(yīng)用MEK抑制劑后，但是有研究表明，該現(xiàn)象的發(fā)生主要在于MEK抑制劑誘導(dǎo)EGFR信號(hào)通路的激活有關(guān)，與經(jīng)典的RAF/MEK/ERK通路介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、凋亡及遷移、侵襲無(wú)相關(guān)性〔7〕。由此提示，U0126影響食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的遷移可能不僅與調(diào)控ERK活性的基本作用有關(guān)，且還有可能通過(guò)非經(jīng)典的ERK途徑發(fā)揮作用。

綜上，U0126可能是通過(guò)下調(diào)E-cadherin和上調(diào)β-catenin表達(dá)，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)KYSE-150細(xì)胞遷移。該研究為臨床試驗(yàn)應(yīng)用MEK抑制劑治療某些腫瘤效果不理想做出合理解釋，提示臨床用藥過(guò)程中不僅要考慮到用藥個(gè)體化，還要考慮到用藥的劑量，以此為臨床抗癌藥物的應(yīng)用提供一定的理論指導(dǎo)。