種肖宇 焦可然 吳妍 張紅 張長庚

(衡水市人民醫(yī)院檢驗科，河北 衡水 053000)

支氣管哮踹是臨床常見的慢性氣道炎癥疾病，可以參與多種細胞的發(fā)生與發(fā)展，如心肌細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等〔1，2〕，呼吸道合胞病毒(RSV)感染細胞后容易引發(fā)肺炎、支氣管炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重者可導致死亡〔3,4〕。支氣管上皮細胞損傷或功能受損可直接導致哮喘的主要病理特征〔5〕，RSV感染支氣管上皮細胞后破壞其細胞結(jié)構(gòu)，造成細胞凋亡產(chǎn)生大量炎癥因子〔6〕。第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)具有蛋白質(zhì)和磷酸酶活性，可以負向調(diào)控磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路維持細胞的生理功能〔7〕，在多種組織和細胞中異常表達，在細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等過程中具有重要作用〔8,9〕。胡彩莉等〔10〕研究結(jié)果顯示，PTEN在哮喘中表達下調(diào)，過表達PTEN可以抑制氣道平滑肌細胞增殖。但是關(guān)于PTEN和RSV感染支氣管上皮細胞的研究機制相對較少，因此本研究通過RSV感染支氣管上皮細胞16HBE，探討過表達PTEN在RSV感染支氣管上皮細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用，旨在為哮喘發(fā)病機制提供合理的技術(shù)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑 人支氣管上皮細胞16HBE購自中國科學院上海細胞庫；RSV-Long病毒2型株購自中國預(yù)防醫(yī)學科學院病毒研究所；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；Prime Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix試劑盒購自大連Takara公司；PTEN抗體、增殖細胞核抗原(PCNA)抗體、B細胞淋巴瘤基因(Bcl)-2抗體和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購自美國Abcam公司；MTT、BCA試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒、白細胞介素(IL)-1β試劑盒和IL-6試劑盒購自上海碧云天公司；凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物公司；丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物研究所；轉(zhuǎn)染空載體(Vector)、PTEN和引物由上海吉瑪公司設(shè)計合成。

1.2細胞培養(yǎng)與分組 將支氣管上皮細胞16HBE在含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基溫度37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，每2 d換一次培養(yǎng)液,在培養(yǎng)液內(nèi)加入0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。選取生長狀態(tài)良好的細胞，將細胞分為4組：(1)RSV組：在支氣管上皮細胞16HBE感染0.000 1 PFU/ml的RSV病毒，2 h后清洗病毒溶液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，然后置于在含有胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h；(2)Control組：支氣管上皮細胞16HBE不做任何處理，常規(guī)條件下正常培養(yǎng)；(3)RSV+vector組：在支氣管上皮細胞16HBE轉(zhuǎn)染空載體(記為vector)后，用RSV感染細胞；(4)RSV+PTEN組：支氣管上皮細胞16HBE轉(zhuǎn)染過表達PTEN(記為PTEN)后，用RSV感染細胞。其中，細胞轉(zhuǎn)染嚴格按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明的操作步驟進行。

1.3qRT-PCR檢測PTEN mRNA表達 取對數(shù)生長期支氣管上皮細胞16HBE，PBS清洗細胞，采用TRIzol試劑分離提取各組細胞總RNA，檢測濃度和純度后，經(jīng)Prime Script RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照SYBR Green Master Mix試劑盒說明進行PCR擴增，以GAPDH為模板，通過2-ΔΔCt法計算PTEN mRNA表達。

1.4Western印跡檢測PTEN、PCNA、Bcl-2和Bax蛋白表達 取對數(shù)生長期支氣管上皮細胞16HBE，在冰上加入蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，通過BCA試劑檢測定量。蛋白變性后，經(jīng)凝膠電泳上樣處理后，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜上，脫脂牛奶封閉培養(yǎng)，再加入一抗PTEN、PCNA、Bcl-2和Bax，4℃孵育過夜培養(yǎng)，然后再加入二抗，室溫下孵育培養(yǎng)2 h，加入化學發(fā)光試劑顯影、曝光，經(jīng)Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白表達。

1.5MTT檢測細胞活力 取對數(shù)生長期支氣管上皮細胞16HBE調(diào)整細胞密度，接種在96孔板內(nèi)，培養(yǎng)48 h后，在每孔內(nèi)加入5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h去掉培養(yǎng)基，加入150 μl的二甲基亞砜溶液，室溫震蕩混勻后，在酶標儀490 nm處檢測吸光度值，計算細胞活力。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期支氣管上皮細胞16HBE，在培養(yǎng)液內(nèi)調(diào)整細胞密度，采用結(jié)合緩沖液與沉淀的細胞懸浮，按照凋亡試劑盒要求加入5 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)、碘化丙啶(PI)溶液，室溫反應(yīng)15～20 min，注意避光反應(yīng)，然后置于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平 取對數(shù)生長期支氣管上皮細胞16HBE，離心后取細胞上清液，嚴格按照MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒說明書，檢測MDA、SOD、GSH-Px、TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞中PTEN表達的影響 與Control組相比，RSV組PTEN mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)，與RSV+vector組相比，RSV+PTEN組PTEN mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.05)，見圖1和表1。

2.2過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞活力的影響 與Control組相比，RSV組的細胞活力、PCNA蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；與RSV+vector組相比，RSV+PTEN組的細胞活力、PCNA蛋白表達均明顯增加(P<0.05)，見表1和圖2。

2.3過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞凋亡的影響 與Control組相比，RSV組的細胞凋亡率、Bax蛋白表達均明顯增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與RSV+vector組相比，RSV+PTEN組的胞凋亡率、Bax蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)，見表1和圖3、4。

2.4過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞氧化應(yīng)激的影響 與Control組相比，RSV組MDA含量明顯增加(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px表達明顯降低(P<0.05)；與RSV+vector組相比，RSV+PTEN組MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD活性和GSH-Px表達明顯增加(P<0.05)，見表2。

2.5過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞炎癥反應(yīng)影響 與Control組相比，RSV組TNF-α、IL-1β、IL-6均明顯增加(P<0.05)；與RSV+vector組相比，RSV+PTEN組TNF-α、IL-1β、IL-6均明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞活力、凋亡及細胞中PTEN表達的影響

圖2 過表達PTEN對RSV感染后 支氣管上皮細胞PCNA蛋白表達的影響

1～4:Control組,RSV組,RSV+vector組,RSV+PTEN組圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

圖4 過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞凋亡的影響

表2 過表達PTEN對RSV感染后支氣管上皮細胞氧化應(yīng)激及細胞炎癥反應(yīng)的影響

3 討 論

支氣管哮踹具有反復發(fā)作、病程長、發(fā)病率高等特點，其發(fā)病機制較為復雜，與遺傳、環(huán)境、吸煙、呼吸道感染、鼻炎等相關(guān)〔11〕。支氣管上皮細胞作為呼吸道第一道防線，在維持呼吸道穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用，但易受到外界因素感染和炎癥反應(yīng)的影響，導致氣道上皮細胞損傷，使其黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)改變和功能異?！?2〕。多數(shù)研究結(jié)果顯示，氣道上皮細胞可以參與哮踹的慢性氣道炎性損傷，受到各種致病菌、過敏原、空氣污染和病毒等因素的影響〔13～15〕。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族是細胞凋亡的兩個重要調(diào)控基因，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bax可以與Bcl-2結(jié)合促進細胞的凋亡〔16〕。脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中MDA可以直接反映支氣管上皮細胞的損傷程度，抗氧化物SOD和GSH-Px可以保護機體組織避免氧化應(yīng)激損傷〔17〕。MDA、SOD和GSH-Px可以作為氧化反應(yīng)的指標，有研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染細胞后導致體內(nèi)氧化應(yīng)激水平失調(diào)，加快肺部炎癥損傷〔6〕。RSV在支氣管上皮細胞中誘導促炎性因子的釋放，進而加重哮喘的炎癥反應(yīng)〔18〕。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSV感染支氣管上皮細胞后可以引起細胞凋亡，導致炎性損傷。本研究通過體外培養(yǎng)支氣管上皮細胞16HBE，研究結(jié)果顯示，RAV誘導支氣管上皮細胞的凋亡，促進細胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制細胞活力。

PTEN在多種癌癥中異常表達，在細胞信號轉(zhuǎn)到、凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中具有重要的作用〔19,20〕，在支氣管上皮細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等多種細胞中發(fā)現(xiàn)PTEN可以參與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展〔21～23〕。由于PTEN自身特有生物活性可以參與多種細胞的生理發(fā)展，如誘導細胞凋亡、抑制細胞的增殖和血管生成等〔24〕。有研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在哮喘中異常表達，同時也發(fā)現(xiàn)在其他呼吸系統(tǒng)疾病中PTEN表達異常，如肺炎等〔25,26〕。本研究結(jié)果顯示，RSV感染支氣管上皮細胞PTEN mRNA和蛋白水平表達下調(diào)，過表達PTEN可以降低RSV誘導的支氣管上皮細胞的凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，促進細胞活力，起到保護支氣管上皮細胞的作用。

綜上，PTEN在RSV誘導支氣管上皮細胞后表達下調(diào)，過表達的PTEN可以促進支氣管上皮細胞的活力，并抑制其細胞凋亡，減緩細胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，為臨床哮喘治療提供潛在的作用靶點。