杜鑫 付保芹 李曉靜 黃曉燕

(1河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院護(hù)理系，河南 安陽(yáng) 455000；2陜西省人民醫(yī)院(陜西省感染與免疫疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室))

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率居于所有惡性腫瘤的第五位，死亡率居于第三位〔1〕。手術(shù)切除是胃癌目前的主要治療手段，但由于患者確診時(shí)大多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果不理想，術(shù)后5年生存率低〔2〕。早期準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胃癌預(yù)后并指導(dǎo)個(gè)體臨床治療決策是提高患者生存率之關(guān)鍵。微小RNA(miR)是一種有9～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，在生物體內(nèi)廣泛存在，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列細(xì)胞生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，且被發(fā)現(xiàn)與胃腸道腫瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展等有緊密關(guān)聯(lián)〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)〔4,5〕，miR-183、miR-144-3p在惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，對(duì)于腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估有重要作用。本研究分析老年胃癌患者胃癌組織中miR-183、miR-144-3p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，并探討預(yù)后判斷價(jià)值，以期為胃癌的靶向治療提供參考思路。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2015年1月至2018年12月陜西省人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除治療的胃癌患者75例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為胃癌；(2)行標(biāo)準(zhǔn)胃癌根治術(shù)(胃切除+胃周第2站淋巴結(jié)清掃)；(3)術(shù)前未接受放化療等抗腫瘤治療；(4)年齡≥60歲；(5)病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并嚴(yán)重肝腎疾病者；(3)非胃癌相關(guān)性死亡者；(4)隨訪等數(shù)據(jù)缺失者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2研究方法 采用門診結(jié)合電話的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月1次，之后每6個(gè)月1次，隨訪截止至2021年5月31日。總生存(OS)時(shí)間是指患者術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始至患者死亡或者隨訪截止日期所經(jīng)歷的時(shí)間。無(wú)進(jìn)展生存(DFS)時(shí)間定義為術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始到局部復(fù)發(fā)/遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或死亡或隨訪截止日期所經(jīng)歷的時(shí)間。收集患者年齡、性別、飲酒史、腫瘤最大徑、腫瘤部位、TNM分期、組織學(xué)類型、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線確定miR-183、miR-144-3p的截?cái)嘀?，?dāng)miR-183相對(duì)表達(dá)量為1.76和miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量為0.62時(shí)，此時(shí)的約登指數(shù)最大。以最佳截?cái)嘀禐?.76和0.62將患者分為miR-183低表達(dá)(<1.76)組(n=34)與miR-183高表達(dá)(≥1.76)組(n=41)和miR-144-3p低表達(dá)(<0.62)組(n=39)與miR-144-3p高表達(dá)(≥0.62)組(n=36)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-183、miR-144-3p表達(dá) 收集患者胃癌組織與癌旁正常組織(距癌組織邊緣>3 cm)，利用TRIzol法進(jìn)行總RNA的提取，采用分光光度計(jì)進(jìn)行總RNA濃度及純度的檢測(cè)，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)DNA，置于-20℃環(huán)境下保存。取總RNA 2 μg，采用熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Forma公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR引物序列：miR-183上游引物5′-CCCGGGCTTGTCTTTTGTT-3′，下游5′-GAGTGGGTGGCTCACTCTTCTG-3′；miR-144-3p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTACAGTATAGATGATGACT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；擴(kuò)增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，共45個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-183、miR-144-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0進(jìn)行正態(tài)分布主量資料t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存差異采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox回歸模型進(jìn)行預(yù)后影響因素分析。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織與癌旁正常組織miR-183、miR-144-3p表達(dá)水平 與癌旁正常組織(1.05±0.17、0.96±0.18)相比，胃癌組織miR-183表達(dá)(2.56±0.28)顯著增高(t=39.922，P<0.001)，miR-144-3p表達(dá)(0.45±0.11)顯著降低(t=20.937,P<0.001)。

2.2胃癌組織miR-183、miR-144-3p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 miR-183高表達(dá)組TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例均顯著高于低表達(dá)組，miR-144-3p低表達(dá)組TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例均顯著高于高表達(dá)組(P<0.05)；不同miR-183、miR-144-3p表達(dá)水平患者年齡、性別、飲酒史、組織分化型、腫瘤原發(fā)灶部位、腫瘤最大徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織miR-183、miR-144-3p表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3胃癌組織miR-183、miR-144-3p表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 患者隨訪8～64個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為32.3個(gè)月。miR-183高表達(dá)組OS率及DFS率均顯著低于miR-183低表達(dá)組，miR-144-3p低表達(dá)組OS率及DFS率均顯著低于miR-144-3p高表達(dá)組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

將TNM分期、有無(wú)脈管癌栓、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-183及miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量等因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素分析和多因素分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-183高表達(dá)、miR-144-3p低表達(dá)均是老年胃癌患者OS及DFS的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表2、3。

圖1 miR-183、miR-144-3p表達(dá)水平與胃癌患者OS、DFS關(guān)系的生存曲線

表2 老年胃癌患者OS影響因素的單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

表3 老年胃癌患者DFS影響因素單因素及多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

3 討 論

胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種基因、多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及多步驟協(xié)同等相關(guān)過(guò)程〔6〕。如何從分子水平闡明其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探尋新的靶向治療方法有重要意義。本研究提示miR-183高表達(dá)及miR-144-3p低表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，并可能成為胃癌靶向治療的重要靶點(diǎn)。

研究表明〔7，8〕，miR可能參與胃癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列生物學(xué)行為，是腫瘤生物標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。miR-183是眾多miRs家族的成員之一，在前脂肪細(xì)胞分化、成熟和腫瘤發(fā)生過(guò)程中起至關(guān)重要的作用〔9〕。本研究顯示，胃癌組織中miR-183表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，與程勇等〔10〕研究報(bào)道一致，提示miR-183可能作為一種癌基因在胃癌發(fā)生過(guò)程中扮演重要角色。本研究說(shuō)明miR-183可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展。miR-183對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)功能主要是通過(guò)其靶蛋白所介導(dǎo)的，其表達(dá)上調(diào)能夠引起免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(LRIG)1 mRNA沉默，下調(diào)抑癌基因LRIG1及其蛋白表達(dá)，使得癌基因與抑癌基因平衡遭到破壞，引起細(xì)胞增殖失衡，從而促進(jìn)腫瘤增殖〔11〕。

miR-144-3p也是一種具有多種生物學(xué)功能的miRNA，在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，被認(rèn)為參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展〔12,13〕。miR-144-3p能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)靶基因的表達(dá)，而對(duì)腫瘤增殖、凋亡過(guò)程產(chǎn)生影響〔14〕。研究表明〔15〕，miR-144-3p可能是一種抑癌基因，其能夠通過(guò)抑制絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)6的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腫瘤增殖產(chǎn)生抑制作用。本研究顯示，胃癌組織中miR-144-3p表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，且miR-144-3p表達(dá)與TNM分期、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與李早紅等〔16〕報(bào)道一致，提示miR-144-3p可能作為一種抑癌基因，參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究說(shuō)明miR-183高表達(dá)、miR-144-3p低表達(dá)與胃癌患者較差的生存期有關(guān)，可能對(duì)胃癌患者預(yù)后有重要提示。Zhang等〔17〕研究表明，miR-183在胃癌組織中表達(dá)增高，其表達(dá)上調(diào)與胃癌較高臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Gao等〔18〕研究顯示，miR-144-3p在胃癌組織中呈低表達(dá)，與生存期獨(dú)立相關(guān)。

綜上，胃癌組織中miR-183表達(dá)上調(diào)、miR-144-3p表達(dá)下調(diào)，miR-183相對(duì)表達(dá)量≥1.76和miR-144-3p相對(duì)表達(dá)量<0.62是老年胃癌患者生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能成為潛在的胃癌預(yù)后新指標(biāo)，并有望為靶向治療提供新思路。