石鳳 王俊利 董明右 龐曉霞 李光景 韋瑩慧

(右江民族醫(yī)學(xué)院 1附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣西 百色 533000；2醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院臨床血液學(xué)與形態(tài)學(xué)教研室)

宮頸癌(CESC)包括宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸腺癌，主要為宮頸鱗狀細(xì)胞癌，占70%以上〔1〕。人乳頭瘤病毒(HPV)感染，性生活，衛(wèi)生條件，遺傳因素及基因突變等是促進(jìn)CESC發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其中長(zhǎng)期高危型HPV感染是引起CESC的主要發(fā)病機(jī)制。近年來，HPV疫苗的使用降低了CESC的發(fā)生率〔2〕。然而，由于其覆蓋率及費(fèi)用，相對(duì)于發(fā)達(dá)國家而言，中低收入國家的CESC患病率高達(dá)四倍〔3〕。世界衛(wèi)生組織報(bào)道CESC的發(fā)病率和死亡率有下降趨勢(shì)，但每年仍有750 000例新增病例數(shù)〔4〕。迄今為止，CESC仍是嚴(yán)重威脅女性身心健康的婦科腫瘤之一。

叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄家族因子(FOXP)3定位于X染色體Xp11.23，含有11個(gè)編碼外顯子，屬于FOX家族蛋白，特征性地表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，參與Treg細(xì)胞的增殖、分化和成熟，控制Treg細(xì)胞的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。FOXP3是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，氨基酸端包含亮氨酸拉鏈、鋅指蛋白和阻遏結(jié)構(gòu)域，羧基端包含叉頭DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)OXP3與Treg細(xì)胞啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的基因表達(dá)，影響其轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)誘導(dǎo)和維持Treg細(xì)胞獨(dú)特的免疫抑制特性至關(guān)重要〔5〕。近年來，越來越多的證據(jù)表明FOXP3在癌癥中發(fā)揮重要作用〔6〕。本研究旨在通過生物信息學(xué)分析FOXP3在不同組織中的表達(dá)及與癌癥的關(guān)系，探討FOXP3表達(dá)水平對(duì)CESC患者總體生存率的影響。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取 從UCSC Xena官網(wǎng)(https://xena.ucsc.edu/)提取33個(gè)腫瘤的TCGA數(shù)據(jù)，包括經(jīng)FPKM是經(jīng)校正后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息；基因突變信息和生存信息。所有的研究數(shù)據(jù)來源于TCGA公共數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對(duì)外開放，因此，不需要相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2FOXP3與CESC臨床特性的相關(guān)性 通過UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/)在線數(shù)據(jù)庫分析FOXP3在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況，并比較分析FOXP3表達(dá)水平與癌癥患者臨床特征的相關(guān)性，包括分級(jí)、種族、體重、年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.3COX回歸分析CESC患者生存分析 通過FOXP3表達(dá)水平中位值將CESC患者分為兩組，分別為高表達(dá)FOXP3組和低表達(dá)FOXP3組。采用COX回歸分析FOXP3基因表達(dá)水平與CESC患者總體生存率的關(guān)系。

1.4FOXP3與腫瘤免疫細(xì)胞的相關(guān)性 輸入癌癥的基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過R3.6.0的“estimate”包對(duì)CESC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行免疫細(xì)胞得分和基質(zhì)細(xì)胞得分。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析在CESC中，F(xiàn)OXP3與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，包括樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和Treg的相關(guān)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過Perl軟件對(duì)TCGA腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因編號(hào)轉(zhuǎn)化為基因名字，對(duì)通過Wilcox秩和檢驗(yàn)比較FOXP3在正常組和CESC組及臨床特征的差異，通過Kaplan-Meier繪制FOXP3表達(dá)水平與CESC患者的生存曲線。通過Spearman檢驗(yàn)分析FOXP3與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，本研究檢驗(yàn)結(jié)果均通過R3.6.0程序計(jì)算所得。

2 結(jié) 果

2.1FOXP3在腫瘤組織中的表達(dá) 將下載的TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過Perl命令提取所需要的輸入文件，包括基因名稱、FOXP3在腫瘤組織中的表達(dá)水平、組織類型和腫瘤類型。通過R3.6.0語言的“ggpubr”包對(duì)FOXP3在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)繪制箱線圖，結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)OXP3在膀胱癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、CESC、結(jié)腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、頭頸部癌(HNSC)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、肺磷癌(LUSC)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、胃癌(STAD)和子宮內(nèi)膜癌(UCEC)中表達(dá)升高，并且與正常組織相對(duì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2FOXP3與CESC臨床特征的分層分析 根據(jù)以上結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3在CESC中的表達(dá)相對(duì)于正常組織顯著升高，為了進(jìn)一步探討FOXP3在CESC亞組中的相對(duì)表達(dá)信息，本研究通過UALCAN網(wǎng)站進(jìn)行分層分析。研究結(jié)果顯示：FOXP3在CESC中的表達(dá)水平〔1.999(1.000～3.845)〕顯著高于正常組〔0.234(0.148～0.317)，P<0.001〕；CESCⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級(jí)的FOXP3表達(dá)水平〔2.181(1.193～3.862)、2.392(0.944～4.674)、1.465(0.998～3.585)、1.028(0.602～1.913)〕均高于正常組(P<0.001)，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的表達(dá)水平高于Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)(圖2)；并隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)OXP3在CESC中表達(dá)呈上升趨勢(shì)〔未轉(zhuǎn)移2.355(1.297～4.341)、轉(zhuǎn)移2.514(0.925～3.678)〕；FOXP3在非裔美國CESC患者中的表達(dá)水平〔2.917(1.410～4.901)〕明顯高于高加索患者〔1.973(0.977～3.487，P<0.001〕，非裔美國CESC患者FOXP3表達(dá)水平高于亞洲患者〔1.665(1.038～4.113)〕，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，F(xiàn)OXP3在CESC患者中的表達(dá)水平還與患者體重和肥胖有關(guān)〔正常體重1.872(0.938～3.467)、超重2.264(1.060～3.599)、肥胖1.942(1.116～2.796)、超肥1.499(1.071～3.822)，P<0.001〕，并隨著年齡的增加，F(xiàn)OXP3在CESC中的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)〔≤40歲1.842(1.042～2.838)、41～60歲1.949(0.943～3.499)、61～80歲2.460(1.248～3.933)，均P<0.001；>80歲0.540(0.401～3.692)，P=0.394〕。

2.3FOXP3的表達(dá)水平與CESC患者的生存率 通過來自TCGA數(shù)據(jù)庫的臨床信息，本研究將FOXP3在不同腫瘤中的表達(dá)水平根據(jù)均值將FOXP3分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用R語言的“COX”包計(jì)算FOXP3表達(dá)水平與CESC患者總體生存率的影響，繪制生存曲線圖和森林圖。如圖2所示，F(xiàn)OXP3高表達(dá)組增加CESC患者的總體生存率(P=0.004)，表明在CESC患者中，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平高的患者預(yù)后較好。

2.4FOXP3與腫瘤的腫瘤突變負(fù)荷(TMB)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI) TMB和MSI是多種腫瘤的有效預(yù)后標(biāo)志物和免疫治療反應(yīng)指標(biāo)。本研究通過R3.6.0繪制雷達(dá)圖對(duì)泛癌進(jìn)行TMB和MSI分析，如圖3所示，本研究未發(fā)現(xiàn)FOXP3與CESC的TMB和MSI有關(guān)。

2.5FOXP3與免疫細(xì)胞浸潤 通過R3.6.0語言的“estimate”包計(jì)算FOXP3來自TCGA數(shù)據(jù)庫中CESC的免疫細(xì)胞得分和基質(zhì)細(xì)胞得分。研究發(fā)現(xiàn)：FOXP3與CESC免疫細(xì)胞得分呈正相關(guān)(r=0.78，P<0.001)；FOXP3與CESC基質(zhì)細(xì)胞得分呈正相關(guān)(r=0.56，P<0.001)。進(jìn)一步分析FOXP3表達(dá)水平與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)水平與CESC中的B細(xì)胞(r=0.546，P<0.001)、樹突細(xì)胞(r=0.494，P<0.001)、巨噬細(xì)胞(r=0.302,P<0.001)、中性粒細(xì)胞(r=0.409,P<0.001)、CD4+T細(xì)胞(r=0.478,P<0.001)、CD8+T細(xì)胞具有顯著相關(guān)性(r=0.327,P<0.001)。

ACC:腎上腺皮質(zhì)瘤; CHOL:膽管癌; DLBC:彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤; GBM:膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;KICH:腎細(xì)胞癌; KIRP:腎乳頭狀細(xì)胞癌; LAML:急性粒細(xì)胞白血病; LGG:低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤;LIHC:肝細(xì)胞癌; LUAD:肺腺癌;MESO:間皮瘤; OV:卵巢漿液性囊腺癌;PAAD:胰腺癌; PCPG:嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤; SARC:肉瘤; SKCM:皮膚黑色素瘤; TGCT:睪丸生殖細(xì)胞瘤; THCA:甲狀腺癌; THYM:胸腺瘤; UCS:子宮癌肉瘤; UVM:葡萄膜黑色素瘤。藍(lán)色：代表FOXP3在正常組織中的表達(dá)量；紅色：代表FOXP3在腫瘤組織中的表達(dá)量；1)P<0.05；2)P<0.01，3)P<0.001，圖3同圖1 FOXP3在腫瘤組織中表達(dá)

左：FOXP3表達(dá)水平與CESC總體生存率；右：FOXP3表達(dá)水平與泛癌總體生存率森林圖圖2 FOXP3表達(dá)水平與腫瘤的總體生存率

TMB：是指每一百萬個(gè)堿基中有多少個(gè)堿基發(fā)生突變；MSI：是指每百萬堿基中重復(fù)序列的缺失或插入的總發(fā)生率圖3 FOXP3表達(dá)水平與泛癌的TMB和MSI的相關(guān)性

3 討 論

近年來，隨著CESC篩查手段的普及及HPV疫苗的廣泛使用，CESC的發(fā)病率和死亡率有下降趨勢(shì)，但每年仍有多數(shù)女性患者死于CESC〔7〕。本研究結(jié)果顯示：FOXP3表達(dá)水平與CESC患者腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，F(xiàn)OXP3在非裔美國CESC患者中的表達(dá)水平顯著高于高加索患者，此外，過度肥胖和超重CESC患者的FOXP3表達(dá)水平相對(duì)于正常體重患者顯著升高，并隨著患者年齡增長(zhǎng)，其表達(dá)水平逐漸升高，而由以上結(jié)果顯示，年齡81～100歲的CESC患者表達(dá)水平反而降低，可能是由于其該年齡段的CESC患者樣本量太小所致，由以上研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)水平升高促進(jìn)CESC的發(fā)生。結(jié)果顯示FOXP3表達(dá)水平越高，CESC患者的總體生存率越好。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)相似的研究結(jié)論也存在于其他癌癥中。Seminerio等〔8〕發(fā)現(xiàn)FOXP3在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)患者的間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于實(shí)體腫瘤，并且FOXP3表達(dá)水平越高，HNSCC患者的預(yù)后越好。Kuwahara等〔9〕發(fā)現(xiàn)FOXP3高表達(dá)提高結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。然而，在一項(xiàng)關(guān)于FOXP3與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的研究中，高浸潤FOXP3與CESC患者的預(yù)后不良有關(guān)〔10〕，但在宮頸腺癌中，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平越高，預(yù)后越好〔11〕。與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的結(jié)果相反。由此可見，F(xiàn)OXP3與癌癥預(yù)后、腫瘤部位、組織類型密切相關(guān)。

TMB和MSI兩者有效反映腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療指標(biāo)。在本研究中，尚未發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)水平與宮頸癌TMB和MSI的相關(guān)性，但在HNSCC和LUSC等腫瘤中，F(xiàn)OXP3表達(dá)的水平與TMB和MSI顯著相關(guān)。FOXP3是Treg細(xì)胞最具特征性的標(biāo)志物，在自身免疫性疾病和腫瘤免疫逃逸中起著重要的作用〔12〕。

綜上，F(xiàn)OXP3在CESC中表達(dá)水平相對(duì)于正常組明顯升高，然而在CESC組中，F(xiàn)OXP3表達(dá)水平越高，總體生存率越好。一項(xiàng)關(guān)于FOXP3與癌癥預(yù)后的meta分析研究顯示：FOXP3在大多數(shù)腫瘤中的預(yù)后差，對(duì)胰腺癌和卵巢癌的預(yù)后無影響，而HNSC、結(jié)直腸癌和ESCA中，F(xiàn)OXP3的浸潤與預(yù)后良好有關(guān)〔13〕。本研究通過生物信息學(xué)研究FOXP3對(duì)CESC預(yù)后的影響與Shah等〔10〕研究者的結(jié)論存在爭(zhēng)議，可能是樣本來源、組織類型等因素的影響。本研究存在以下不足：研究數(shù)據(jù)均來自TCGA公共數(shù)據(jù)庫，人群選擇，組織類型等異質(zhì)性大，未進(jìn)行臨床樣本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可能與其他研究存在爭(zhēng)議。