吳 晉，趙 婧，龐 濤

（1. 福建省藥品審核查驗(yàn)中心, 福建 福州 350003； 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院：a. 中醫(yī)科, b. 藥劑科, 上海 200003）

肺脾氣虛湯由法半夏，陳皮，黨參，炙黃芪，茯苓，藿香，砂仁等七味中藥組成，其中，炙黃芪、黨參共為君藥，補(bǔ)肺脾之氣，益衛(wèi)固表，法半夏、陳皮、茯苓，健脾祛濕，化痰利肺是為臣藥，藿香芳香化濁，辟穢和中，是為佐藥，砂仁行氣調(diào)中，和胃醒脾，為使藥。作為從第4 版新型冠狀病毒感染肺炎診療方案便被納入中醫(yī)治療方案的方劑之一，該方主治新冠患者恢復(fù)期出現(xiàn)的肺脾氣虛證，對(duì)氣短、倦怠乏力、納差嘔惡、痞滿、大便無力、便溏不爽、舌淡胖、苔白膩等癥狀具有良好療效[1]。但治療新冠的中藥方劑均由多味中藥組成，化學(xué)成分復(fù)雜，目前諸多文獻(xiàn)均側(cè)重于基于公開數(shù)據(jù)庫查詢方劑組成的各個(gè)藥味所含的化合物開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[2-5]，而沒有對(duì)方劑的化學(xué)成分群進(jìn)行系統(tǒng)考察。其次，中藥復(fù)方體內(nèi)與體外之間化學(xué)成分具有重要關(guān)聯(lián)，針對(duì)復(fù)方進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的化學(xué)成分群進(jìn)行分析是有助于發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)的有效手段[6]。

目前尚未見肺脾氣虛湯的化學(xué)成分及入血成分研究的報(bào)道，因此本研究通過UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)首次對(duì)肺脾氣虛湯所含化學(xué)成分進(jìn)行快速分析鑒定，并對(duì)化學(xué)成分的藥材來源進(jìn)行歸屬，在此基礎(chǔ)上開展其血中藥源性成分的辨識(shí)，以期為進(jìn)一步闡明肺脾氣虛湯的活性成分，并為今后質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UHPLC-Q-TOF/MS）購自美國安捷倫公司，包含1290 Infinity 型UHPLC 及6530 型Q-TOF/MS 系統(tǒng)；CPA255D 型1/10 萬電子天平購自德國Sartorius公司；Lyovapor L-200 型冷凍干燥機(jī)購自瑞士Buchi 公司；Centrifuge 5810R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司；SK7200H 型超聲波清洗器購自上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；Milli-Q 型純化水系統(tǒng)購自美國Millipore 公司；HC-800Y 高速多功能粉碎機(jī)購自武義海納電器有限公司。

1.2 藥品與試劑

法 半 夏（ 批 號(hào)191115042） 、 陳 皮（ 批 號(hào)19090603）、黨參（批號(hào)19102901）、炙黃芪（批號(hào)19650710）、茯苓（批號(hào)19122304）、藿香（批號(hào)19051410）、砂仁（批號(hào)19102211）等飲片均購自吳江上海蔡同德堂中藥飲片有限公司，以上樣品均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)陳萬生教授鑒定為正品。

琥珀酸（批號(hào)A0727AS）、綠原酸（批號(hào)J0120AS）、蘆?。ㄅ?hào)O0714AS）、芒柄花素（批號(hào)N0301AS）等對(duì)照品均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（純度＞97.0 %）。甲醇、乙腈為質(zhì)譜純（德國Merck 公司）；甲酸為質(zhì)譜純（美國 Thermo Fisher 公司）；超純水由MILI-Q 凈水系統(tǒng)制備（美國Millipore 公司）；其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為8 周齡雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部（合格證編號(hào)20 180 006 021 172），大鼠飼養(yǎng)于溫度（22～26 ℃）、濕度（40%～70%）、12 h 明暗循環(huán)可控的室內(nèi)環(huán)境，可自由進(jìn)食飲水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取琥珀酸，加入超純水配置成濃度為1.0 mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密稱取綠原酸、蘆丁、芒柄花素各對(duì)照品適量，加入含5% DMSO的甲醇分別配置成濃度為1.0 mg/ml 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，所有儲(chǔ)備液配制完成后均放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。精密吸取上述?chǔ)備溶液各10 μl，置于1.5 ml離心管中，加入甲醇，渦旋混勻，配制成各對(duì)照品濃度均為10 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

將方劑所有藥材冷凍干燥，用高速粉碎機(jī)分別打粉并過四號(hào)篩，并按處方比例混合，精密稱取約0.500 g，置于100 ml 具塞錐形瓶中，精密加入10 倍體積70 %甲醇，密塞、稱定重量，超聲波提取法提?。?60 W，50 kHz）30 min，冷卻，70 %甲醇補(bǔ)足失重，濾過，3 000 r/min 離心10 min，取1.0 ml 上清液于1.5 ml EP 管中，12 000 r/min 離心 10 min，取200 μl 上清液于進(jìn)樣小瓶中，待進(jìn)樣分析。另取方劑10 倍體積純凈水浸泡過夜，回流提取1.5 h 后用紗布過濾，藥渣用8 倍體積水繼續(xù)回流提取1 h，過濾并離心，合并上清液，減壓濃縮，得到浸膏供入血成分分析研究。

2.3 血清樣本的制備和前處理

SD 大鼠給藥前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為2 組，即空白對(duì)照組與肺脾氣虛湯給藥組，每組6 只。給藥組大鼠灌胃給予方劑提取物（10 倍臨床給藥劑量），空白對(duì)照組大鼠灌胃給予等體積水。給藥1 h 后眼眶靜脈叢取血1.5 ml 于5 ml 促凝管中, 室溫下靜置2 h，4 °C 下3 000 r/min 離心10 min，取100 μl 血清于1.5 ml EP 管中，加入4 倍體積甲醇，渦旋混勻1 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，取上清液，真空冷凍干燥后，加入100 μl 80% 甲醇復(fù)溶，渦旋混勻1 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 UHPLC-Q-TOF/MS 分析條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：0.1 %甲酸水（A）-乙腈（B），色譜洗脫梯度見表1，后運(yùn)行時(shí)間為 3 min；流速0.3 ml/min；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣體積2 μl，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm。

采用電噴霧離子源（ESI），分別在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍m/z100～1 700，離子源溫度 350 ℃，毛細(xì)管電壓正離子為 4.0 kV，負(fù)離子為 3.5 kV，霧化氣壓力 45 Psi，干燥氣流速 11 L/min，鞘氣流速 11 L/min，鞘氣溫度 350 ℃，碎片電壓 140 V，碰撞能量 30 V。

表1 色譜洗脫梯度

2.5 肺脾氣虛湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

基于中國知網(wǎng)、Pubmed、TCMSP 等中英文在線數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，查詢肺脾氣虛湯各味藥材所含化學(xué)成分，并匯總其化學(xué)成分信息，導(dǎo)入Agilent PCDL Manager B.08 軟件構(gòu)建方劑化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

3 結(jié)果

3.1 肺脾氣虛湯的化學(xué)成分鑒定結(jié)果

將采集得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0 軟件中，利用前期建立的肺脾氣虛湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫初步識(shí)別其所含化學(xué)成分（絕對(duì)峰高≥2 000，匹配容差＜±5 ppm），接下來對(duì)初步識(shí)別的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。采用對(duì)照品及MS DIAL4.70 軟件結(jié)合MS FINDER 3.5.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫及離子碎片比對(duì)功能確認(rèn)化合物信息[7]。

肺脾氣虛湯在“2.2”及“2.4”項(xiàng)條件下得到的總離子流色譜圖見圖1。通過導(dǎo)入自建數(shù)據(jù)庫得到肺脾氣虛湯的初步鑒定結(jié)果，并進(jìn)一步通過與對(duì)照品、MS FINDER 數(shù)據(jù)庫比對(duì)及查閱文獻(xiàn)等方法最終共從肺脾氣虛湯鑒定出56 種化學(xué)成分，見表2。其中正離子模式下識(shí)別出8 種化學(xué)成分，負(fù)離子模式下識(shí)別出46 種化學(xué)成分。此外，大豆皂苷 I 和茯苓酸在正、負(fù)兩種模式下均被識(shí)別到。這些成分中有4 種成分來源于法半夏[13-14]，9 種成分來源于陳皮，7 種成分來源于黨參[15-16]，10 種成分來源于茯苓[17-18]，13 種成分來源于炙黃芪[19-20]，1 種成分來源于藿香[21]，3 種成分來源于砂仁[22]。此外，也有化學(xué)成分為多個(gè)藥材的共有成分，均在表格中標(biāo)出。化合物來源占比最高的為炙黃芪、黨參等藥材，與其配伍占比相似。

肺脾氣虛湯含有多種有機(jī)酸類成分，如原兒茶酸、阿魏酸等，該類成分在質(zhì)譜中易在能量的撞擊下丟失CO2、CH2、CO 等分子。如化合物11 在7.141 min 產(chǎn)生m/z153.019 4[M-H]-峰，判斷該化合物的分子式為C7H6O4，在二級(jí)質(zhì)譜掃描下產(chǎn)生m/z109.028 8，推測(cè)其為m/z153.019 4 丟失一分子CO2產(chǎn)生的碎片離子，通過與對(duì)照品及MS FINDER數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)綜合比對(duì)，鑒定該化合物為原兒茶酸[23]，裂解規(guī)律見圖2。化合物14 在8.86 min 產(chǎn)生m/z193.050 8[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，判斷其分子式為C10H10O4，而二級(jí)質(zhì)譜圖中可觀察到m/z178.031 0、m/z149.060 3、m/z134.037 6 等碎片離子，推測(cè)它們分別為準(zhǔn)分子離子峰產(chǎn)生的[M-CH2-H]-峰、[M-CO2-H]-峰、[M-CO2-CO2-H]-峰，根據(jù)參考文獻(xiàn)及MS FINDER 數(shù)據(jù)庫推測(cè)該化合物為阿魏酸[24]。

圖1 肺脾氣虛湯供試品總離子流色譜圖

表2 肺脾氣虛湯化學(xué)成分鑒定結(jié)果

(續(xù)表2)

黃酮類成分為肺脾氣虛湯中檢測(cè)到的主要類別，該類成分易在質(zhì)譜掃描下發(fā)生糖苷鍵的斷裂、脫羰基、脫甲基及RDA 裂解等[25]。如化合物13 可在8.211 min 觀察到m/z741.224 5[M-H]-峰，判斷其分子式為C33H42O19，在其質(zhì)譜碎片中觀察到m/z433.114 3[M-C12H20O9-H]-及m/z271.063 2[M-C12H20O9-C6H10O5-H]-，為其逐步丟失糖苷鍵產(chǎn)生的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)及MS FINDER 數(shù)據(jù)庫推測(cè)該化合物為柚皮苷4’-葡萄糖苷?；衔?2 可在16.761 min 觀察到其準(zhǔn)分子離子峰m/z313.072 0，判斷其分子式為C16H12O4，并觀察到m/z253.053 6，為該化合物脫去甲基產(chǎn)生的碎片離子[M-CH2-H]-，與對(duì)照品及MS FINDER 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定該化合物為芒柄花素， 柚皮苷4’-葡萄糖苷及芒柄花素裂解規(guī)律見圖3。

3.2 肺脾氣虛湯的入血成分鑒定

將血清樣本數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0 軟件中，并將3.1 項(xiàng)中識(shí)別得到的化合物構(gòu)建為帶有保留時(shí)間的肺脾氣虛湯入血成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，根據(jù)化合物的保留時(shí)間及分子特征共篩選得到肺脾氣虛湯的11 種入血原形成分（圖4，表2）。其中，茯苓酸來源于茯苓，琥珀酸來源于黨參、法半夏，十五烷酸、棕櫚酸來源于法半夏，原兒茶酸來源于藿香、砂仁，對(duì)羥基苯甲酸來源于砂仁，芒柄花素和黃芪甲苷IV 來源于炙黃芪，新橙皮苷及順-10-十七碳烯酸甲酯來源于陳皮，亞油酸來源于黨參、炙黃芪和法半夏。

圖2 原兒茶酸及阿魏酸可能的裂解途徑

圖3 柚皮苷4’-葡萄糖苷 及芒柄花素可能的裂解途徑

圖4 血清樣本總離子流色譜圖

4 討論

新冠肺炎患者恢復(fù)期常見的中醫(yī)證候有肺脾氣虛、氣陰兩虛和余邪未盡。另外，由于患者的脾胃失和氣陰兩虛，容易出現(xiàn)情志失調(diào)。肺脾氣虛湯含有黃芪、黨參、茯苓、陳皮、半夏、藿香、砂仁等，具有扶正祛邪、補(bǔ)肺固表、益氣健脾、燥濕化痰、化濁除濕之功，為香砂六君子湯、參苓白術(shù)散、補(bǔ)中益氣湯的主要組成藥物[7-10]。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度來說，使用上述藥物，可以有效防止恢復(fù)期患者出現(xiàn)凝血、炎癥、免疫和器官功能障礙[11]，以及穩(wěn)定患者情緒防止病情演變的作用[12]。

根據(jù)我們的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，入血原形成分中原兒茶酸、新橙皮苷等是具有代表性的有效成分，在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中均被證實(shí)有助于新冠肺炎患者的“扶正祛邪”。例如，來自于藿香的原兒茶酸由于具有多個(gè)酚羥基，已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抑制蛋白酶3CLpro 的功能[26]，發(fā)揮抗炎活性[27]；還可以通過改善海馬和大腦皮層中的神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌因子改善抑郁大鼠的行為和神經(jīng)生化改變[28]。新橙皮苷是黃酮類化合物的主要活性成分，具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化特性，以及神經(jīng)保護(hù)和安神作用[29]，近期研究表明其由于具有與人類AAK1 蛋白和SARSCoV-2 NSP16 蛋白結(jié)合的潛力，被作為一種潛在的雙重活性成分而受到關(guān)注[30-31]。黃芪甲苷 IV 是黃芪的主要活性成分，在機(jī)體免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種系統(tǒng)具有正向調(diào)節(jié)作用[32-33]。上述成分經(jīng)口服被吸收入血在體內(nèi)進(jìn)行循環(huán)，證實(shí)了方劑多成分多途徑發(fā)揮功效的特點(diǎn)，是肺脾氣虛湯發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本研究首次運(yùn)用UHPLC-Q-TOF/MS 對(duì)肺脾氣虛湯的化學(xué)成分和入血成分進(jìn)行分析，所鑒別出的化合物為其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，該方法準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析時(shí)間短，證實(shí)了基于入血成分的活性成分識(shí)別是一種篩選中藥活性物質(zhì)的快速有效方法。