劉 靜，徐 熠，吳鐵軍，黃 瑾

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科, 上海 200437）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA) 是一種以滑膜關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀硇?、進行性自身免疫性疾病。疾病最早開始表現(xiàn)是滑膜炎，繼而引發(fā)骨損傷及侵蝕，直至骨關(guān)節(jié)畸形及功能障礙[1-2]，RA 動物模型中廣泛使用的是佐劑性關(guān)節(jié)炎模型和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。佐劑性關(guān)節(jié)炎又稱弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎，是建立免疫性關(guān)節(jié)炎動物模型的基本方法[3]。RA 發(fā)病機制還不明確，目前缺乏理想的治療方案。臨床上治療RA 主要是非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥物及糖皮質(zhì)激素等[4]，但往往因為藥物的不良反應(yīng)、價格等因素，難以堅持長期服藥。

茵連痛風(fēng)顆粒是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，由菌陳、連錢草、伸筋草組成，具有清熱利濕、通絡(luò)的功效。其處方是依據(jù)滬上著名夏氏外科傳人夏涵教授數(shù)年臨床經(jīng)驗方制成，用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，臨床具有顯著療效[5]。本實驗通過弗氏完全佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎模型，觀察茵連痛風(fēng)顆粒對佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響，為茵連痛風(fēng)顆粒的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

茵連痛風(fēng)顆粒（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科自制，滬藥制字：Z05050342，批號：1811001）；塞來昔布膠囊（輝瑞制藥有限公司，批號：AN8171）；弗氏完全佐劑（Sigma 公司）； IL-10、IL-4、前動力蛋白（PK1、2）酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 動物

SD 大鼠，雄性，體重(160±10)g，[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005]。

1.3 儀器

酶標儀(型號:DENLEY DRAGON Wellscan MK3，公司：Thermo)；離心機(型號：TGL-168，公司：上海安亭科學(xué)儀器廠)；數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：PYX-DHS，公司：上海躍進醫(yī)療器械廠）；自制刻度軟尺。

2 方法

2.1 分組給藥和模型建立

將48 只SD 雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為6 組，每組8 只。分別為正常組，模型組，塞來昔布陽性組（0.017 g/kg），茵連痛風(fēng)顆粒高劑量組（15.4 g/kg），茵連痛風(fēng)顆粒中劑量組（7.7 g/kg），茵連痛風(fēng)顆粒低劑量組（3.8 g/kg）。除正常組外，其余各組大鼠右后足皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑 0.1 ml/足。注射弗氏完全佐劑后第8 天，按照如上劑量灌胃給予相應(yīng)濃度的受試藥品，正常組和模型組給予等體積蒸餾水，每天給藥1 次，連續(xù)給藥28 d。

模型鑒定：造模后各組大鼠的皮膚腫脹，皮膚溫度及踝關(guān)節(jié)腫脹度與正常組之間是否有統(tǒng)計學(xué)差異，是模型成功與否的判定標準。

2.2 實驗方法

2.2.1 大鼠一般情況和關(guān)節(jié)炎癥狀評分

分別在大鼠給藥后7、14、28 d 記錄大鼠四肢關(guān)節(jié)病變程度，采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分分級法評價大鼠病變程度。關(guān)節(jié)炎指數(shù)分為 5 級（0～4 分）：0 分，關(guān)節(jié)無紅腫；l 分，單個趾關(guān)節(jié)明顯紅腫；2 分，發(fā)紅并（或）腫脹關(guān)節(jié)＞l 個；3 分，整個足及跖關(guān)節(jié)明顯紅腫；4 分，嚴重的關(guān)節(jié)腫脹或畸形。根據(jù)未注射佐劑的余下肢體的病變程度累計積分，計算出AI（各個關(guān)節(jié)的積分累計起來，即為每只大鼠的AI）。

2.2.2 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度影響

分別于造模前、給藥后1 d、以及每間隔8 d，用刻度軟尺測量大鼠右后踝關(guān)節(jié)周長，并觀察各組動物關(guān)節(jié)病變情況。按照下列公式計算踝關(guān)節(jié)腫脹率：踝關(guān)節(jié)腫脹率=(致炎后踝關(guān)節(jié)周長-致炎前踝關(guān)節(jié)周長) /致炎前踝關(guān)節(jié)周長×100% 。

2.2.3 對大鼠甲醛致痛的影響[6]

末次給藥后2 h，于大鼠左足趾皮下注射50 μl 2.5%甲醛，觀察1～10 min（第I 時相）和10～30 min（第II 時相）的行為反應(yīng)。評分標準：第I 時相抬足1 次，計1 分；第II 時相舔足、咬足或抖足1 次，計2 分。計算30 min 內(nèi)的總得分。

2.2.4 血清炎癥指標檢測和病理組織觀察

末次給藥后禁食、禁水12 h，大鼠注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）進行麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，用ELISA 法檢測血清中IL-10、IL-4、PK1、PK2 含量； 各組大鼠取左側(cè)足掌肉墊，福馬林固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋、切片和HE 染色，病理組織學(xué)觀察。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠一般情況及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

造模前各組大鼠毛色光亮，動作敏捷，精神狀態(tài)和飲食均良好。模型組大鼠在造模后，自主活動減少、足底局部出現(xiàn)紅腫，后期整只爪和關(guān)節(jié)均有不同程度腫脹，最初表現(xiàn)為足部腫脹，而后腫脹向上到達踝關(guān)節(jié)，腫脹部位皮膚發(fā)紅，溫度升高。隨著時間延長，大鼠食欲減退，毛色暗黃，且運動功能逐漸減退。給予茵連痛風(fēng)顆粒高、中、低劑量組及塞來昔布陽性組大鼠精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，關(guān)節(jié)腫脹度、食欲等有不同程度的緩解。表1 結(jié)果表明，與模型組比較，給藥7、14、28 d 后，茵連痛風(fēng)顆粒高、中劑量組和陽性組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

3.2 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度影響

表2 結(jié)果顯示，與同期正常組比較，模型組在給藥第9 天時腫脹率達峰值， 17d 開始，腫脹逐日減輕，給藥第9 天開始，陽性組和茵連痛風(fēng)顆粒高劑量組足腫脹與模型組比較，腫脹明顯減輕，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）；在給藥第25、28 天，茵連痛風(fēng)顆粒中劑組與模型組有顯著性差異（P＜0.05），茵連痛風(fēng)顆粒低劑組無明顯差異。結(jié)果顯示了茵連痛風(fēng)顆粒對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠原發(fā)足踝關(guān)節(jié)腫脹有劑量依賴性抑制作用。

表1 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 (±s，n=8)

表1 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 (±s，n=8)

*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較；##P＜0.01，與正常組比較。

給藥后關(guān)節(jié)炎指數(shù)第7天 第14天 第28天正常組 — 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 — 6.37±0.52## 9.63±0.74## 8.38±0.92##陽性組 0.017 5.63±0.51** 6.50±0.93** 4.38±0.52**高劑量組 15.4 5.50±0.53** 7.13±0.0.83** 4.13±0.64**中劑量組 7.7 5.75±0.46** 8.13±0.0.83** 5.63±0.52**低劑量組 3.8 5.88±0.35* 9.13±0.81 8.13±0.74組別 劑量(g/kg)

3.3 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠甲醛致痛的影響

與模型組比較，在I 時相和II 時相，陽性組和茵連痛風(fēng)顆粒高、中、低劑量組可顯著降低甲醛致痛分值（P＜0.01），表明茵連痛風(fēng)顆粒具有很好的鎮(zhèn)痛作用（表3）。

3.4 茵連痛風(fēng)顆粒對IL-4、IL-10、PK1、PK2 的影響

模型組大鼠IL-10，IL-4 與正常組相比顯著降低（P＜0.01），炎性反應(yīng)較明顯；茵連痛風(fēng)顆粒各組和陽性組均能升高IL-10，IL-4 水平。同時，模型組大鼠 PK1、PK2 水平與正常組相比顯著升高（P＜0.01），陽性組和茵連痛風(fēng)顆粒各組均能降低兩者水平，與模型組比較有顯著差異 （P＜0.01），其中，茵連痛風(fēng)顆粒高劑量組更明顯（表4）。

3.5 病理觀察

由圖1 可見，正常對照組足趾肉墊無炎癥細胞浸潤，而模型組可見大量淋巴細胞浸潤。塞來昔布組可見淋巴細胞浸潤程度的大幅度降低，而茵連痛風(fēng)顆粒高、中、低劑量組均可降低淋巴細胞浸潤，而以茵連痛風(fēng)顆粒高劑量組最為顯著。

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)歸屬“痹癥”范疇，治療以祛風(fēng)除濕、散寒通絡(luò)、扶正固本、清熱解毒為主[7]。茵連痛風(fēng)顆粒有茵陳、連錢草、伸筋草三味藥材組成。茵陳作為君藥，具有清利濕熱、芳香舒脾、透表暢氣之效；臣藥連錢草，取其消石之功，防止痛風(fēng)性尿路結(jié)石的產(chǎn)生，具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫之功效；佐藥伸筋草具有祛風(fēng)除濕、舒筋活血之效，為治痹痛拘攣及傷損瘀腫之要藥，配伍茵陳可以增強該復(fù)方利濕通絡(luò)的作用。該方配伍符合中醫(yī)理論對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的認識[8]。

弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎動物模型是經(jīng)典的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的病因、病癥更接近。它能較為真實地反映類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理進程，與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎同屬中醫(yī) “痹證”“白虎歷節(jié)風(fēng)”范疇，而且制備方法簡便、易重復(fù)。常用于關(guān)節(jié)炎藥物的藥效評估[9]。IL-4、IL-10 細胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，起到十分重要的作用。這類細胞因子與滑膜炎性反應(yīng)、增生及關(guān)節(jié)變形有著密切的關(guān)系。PK 信號通路是近年新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)通路，包括兩種結(jié)構(gòu)上關(guān)聯(lián)的小分子肽PK1 和PK2 及相應(yīng)的G 蛋白偶聯(lián)受體PK（PKR1 和PKR2），PKs 及其受體PKRs 廣泛分布在許多人體組織中。在免疫細胞中參與炎癥發(fā)生和疼痛傳遞的重要環(huán)節(jié)，如PK2 參與免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)骨髓細胞分化為單核細胞系和巨噬細胞系，并通過激活單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞上的 PKRs，釋放IL-1、IL-6、TNF-a 等炎性細胞因子，觸發(fā)和維持炎性疼痛，調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)在前動力蛋白信號通路中加入PKRs 激動劑可以顯著降低IL-10 和IL-4 生成[12]。損傷組織中釋放的PKs 是免疫-炎癥反應(yīng)的一種自分泌或旁分泌的調(diào)節(jié)劑，能夠刺激神經(jīng)元中PKRs 而增強傷害性感受器的敏感性，說明PKs 信號通路在調(diào)節(jié)傷害性感受閾方面發(fā)揮重要功能，因此阻斷PKs 信號通路是目前治療炎性疼痛的新策略[11]。然而，關(guān)于PK 信號通路在中藥鎮(zhèn)痛方面的研究報道較少，其干預(yù)中藥鎮(zhèn)痛的具體機制有待進一步研究證實。本實驗結(jié)果顯示，茵連痛風(fēng)顆?？擅黠@減輕RA 大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹，按照人和大鼠之間的體表面積換算成大鼠的給藥中劑量，并設(shè)置高、中、低3 個劑量組。以高劑量組改善最為明顯，并呈現(xiàn)劑量依賴性。同時，病理結(jié)果顯示，茵連痛風(fēng)顆粒高中低劑量組均可降低淋巴細胞浸潤，以茵連痛風(fēng)顆粒高劑量組最為顯著。其作用機制可能是通過PK 信號通路抑制PK1、PK2 分泌，以及促進細胞因子IL-4、IL-10 等分泌達到抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。為茵連痛風(fēng)顆粒作用機制的闡明打下了基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果表明，茵連痛風(fēng)顆粒對佐劑關(guān)節(jié)炎具有明顯抑制作用，暗示其對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療前景，作用機制有待進一步研究。

表2 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹率的影響 ( x ˉ±s，n=8)

表3 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠甲醛致痛的影響 (±s，n=8)

表3 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠甲醛致痛的影響 (±s，n=8)

**P＜0.01；與模型組比較； ##P＜0.01，與正常組比較。

甲醛致痛分值1～10 min（Ⅰ時相） 10～30 min（Ⅱ時相）正常組 — 2.38±0.52 1.38±0.52模型組 — 33.63±1.41## 14.88±1.64##陽性組 0.017 11.38±1.06** 3.50±0.93**高劑量組 15.4 12.13±0.99** 3.25±1.04**中劑量組 7.7 16.00±1.60** 5.25±0.89**低劑量組 3.8 19.38±1.19** 6.50±1.20**組 別 劑量 (g/kg)

表4 茵連痛風(fēng)顆粒對大鼠血清IL-4、IL-10、PK1、PK2 的影響 ( x ˉ±s，n=8)

圖1 大鼠足趾肉墊病理切片HE 染色(×200)