張冬梅，高迎春，何 蕾，陳克明，李文斌，王 榮，馬慧萍

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050）

低壓低氧、低溫和強(qiáng)紫外線輻射是高原環(huán)境的主要特點(diǎn)，腦組織以有氧代謝為主，由于其耗氧量大、貯氧量少、代謝率高的特點(diǎn)，是對(duì)缺氧最為敏感的器官，高原缺氧時(shí)神經(jīng)細(xì)胞首先出現(xiàn)能量代謝障礙，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷甚至死亡，細(xì)胞凋亡是缺氧導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要機(jī)制。5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（5-HTT）是由SLC6A4 基因編碼的一種鈉依賴的單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在大腦神經(jīng)元、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、血小板等體細(xì)胞中均有表達(dá)，主要功能是將細(xì)胞外的5-HT 再攝取至細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理作用[1]。5-HT 作為活性氧化物自身具有細(xì)胞毒性，濃度過(guò)高則可產(chǎn)生大量的內(nèi)源性氧化物導(dǎo)致線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[2]，前期研究表明，缺氧可以誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡、5-HTT 表達(dá)升高，給予一定劑量的5-HTT 抑制劑鹽酸氟西汀后可以降低PC12 細(xì)胞5-HTT 表達(dá)和凋亡，從而保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷[3-4]，另有研究表明，高原缺氧會(huì)導(dǎo)致肺組織中5-HTT 表達(dá)升高，機(jī)制與細(xì)胞凋亡有關(guān)[5-6]，為了論證5-HTT 的表達(dá)變化在缺氧神經(jīng)細(xì)胞中的作用，我們利用RNA 干擾（RNAi）的方法構(gòu)建靶向SLC6A4 基因的短發(fā)夾RNA （shRNA）重組慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體，建立PC12 細(xì)胞SLC6A4 基因干擾的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，抑制PC12 細(xì)胞中SLC6A4 基因表達(dá)以及5-HTT 蛋白的表達(dá)，測(cè)定缺氧情況下沉默SLC6A4 基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，以期為高原神經(jīng)損傷相關(guān)疾病的研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

RNA 干擾（RNAi）重組慢病毒載體GV248、病毒包裝輔助質(zhì)粒（pHelper1.0 和pHelper2.0 載體）、人胚腎上皮細(xì)胞系293T 細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、DNA oligo、鑒定引物（R＆F）及DNA 測(cè)序（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；大鼠嗜鉻瘤PC12 細(xì)胞系（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，ATCC）；二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、0.25%Trypsin-EDTA 胰酶（1×）、胎牛血清、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、0.25%胰酶消化液（美國(guó)Gibco 公司）；CCK-8 試劑盒（日本同仁公司）；FITC 標(biāo)記Annexin V/PI 凋亡試劑盒（美國(guó)BD 公司）；EST-10-02 氧濃度測(cè)定儀(美國(guó)ESTESNROS 公司）；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；三氣培養(yǎng)箱(德國(guó)Memmert 公司)；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)（中國(guó)杭州凈化工作設(shè)備廠）；SpectraMaxi3 全自動(dòng)熒光酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)艾森公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將PC12 細(xì)胞培養(yǎng)于F12-K 培養(yǎng)基中，其中含有15%馬血清、2.5%的胎牛血清以及1%雙抗（100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素）。293T 培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，兩種細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)采用1%O2模擬缺氧環(huán)境。

1.2.2 攜帶表達(dá)SLC6A4-shRNA 慢病毒干擾載體的構(gòu)建

根據(jù)Genbank SLC6A4 基因轉(zhuǎn)錄本（NM_013034），利用軟件設(shè)計(jì)3 條針對(duì)SLC6A4 基因干擾靶序列（表1），3 條DNA oligo 分別包含有21 個(gè)堿基正義鏈、6 個(gè)核苷酸序列的loop 環(huán)和互補(bǔ)21 個(gè)堿基的反義鏈，在5'端分別加上限制性核酸內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，在3'端加入RNA polyⅢ聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTT，反義鏈5 '加入終止信號(hào)互補(bǔ)序列。同時(shí)，以一段無(wú)關(guān)序列作為陰性對(duì)照（NC，即干擾對(duì)照組）。將DNA oligo 復(fù)性后配對(duì)產(chǎn)生雙鏈，通過(guò)其兩端所含酶切位點(diǎn)采用T4連接酶與酶切后的慢病毒載體GV248 在16 ℃連接過(guò)夜，構(gòu)建3 種目的基因的重組慢病毒質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒（ SLC6A4-shRNA-GV248-1、 SLC6A4-shRNAGV248-2、SLC6A4-shRNA-GV248-3 和NC-shRNAGV248），轉(zhuǎn)入準(zhǔn)備好的感受態(tài)大腸桿菌DH5α 中，挑取陽(yáng)性克隆，GV248 通用引物進(jìn)行PCR 電泳及測(cè)序鑒定。由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和包裝。

表1 SLC6A4-shRNA 干擾序列

1.2.3 shControl、shSLC6A4 慢病毒的包裝與滴度測(cè)定

重組慢病毒質(zhì)粒（SLC6A4-shRNA-GV248-1、SLC6A4-shRNA-GV248-2、 SLC6A4-shRNA-GV 248-3 和NC-shRNA-GV248）與輔助質(zhì)粒（pHelper 1.0 載體質(zhì)粒、pHelper 2.0 載體質(zhì)粒）重組慢病毒質(zhì)粒（ SLC6A4-shRNA-GV248-1、 SLC6A4-shRNAGV248-2、SLC6A4-shRNA-GV248-3 和NC-shRNAGV248）與輔助質(zhì)粒（pHelper 1.0 載體質(zhì)粒、pHelper 2.0 載體質(zhì)粒），當(dāng)293T 的細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，3 個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒和空慢病毒載體分別與輔助包裝載體質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，用Lipofectamine TM 2000 共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)6 h，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和GFP 表達(dá)，48 h后收集上清液，20 000r/min 超速離心3 h 并濃縮病毒，最后包裝產(chǎn)生慢病毒，即含有3 條SLC6A4基因序列的慢病毒EGFP-shSLC6A4-1、EGFPshSLC6A4-2、EGFP-shSLC6A4-3。4 ℃，1 500 r/min離心5 min，吸取上清液，再用0.45 μm濾器過(guò)濾，離心濃縮，得到重組慢病毒，測(cè)定病毒滴度后，分裝在-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 重組慢病毒感染PC12 細(xì)胞獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12 細(xì)胞于感染前24 h 接種于6 孔板中，接種體積為2 ml/孔，細(xì)胞數(shù)目同為5×104個(gè)/ml。用病毒原液感染狀態(tài)較好的PC12 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)設(shè)SLC6A4 干擾組（ShSLC6A4-1/ShSLC6A4-2/ShSLC6A4-3），空載體組（VECTOR）。按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的感染復(fù)數(shù)（MOI）感染細(xì)胞（MOI=100），加入5 μg/ml 的轉(zhuǎn)染增敏劑凝聚胺。12 h 后更換為完全培養(yǎng)基，72 h 后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光即綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況，用含2 μg/ml 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基替換病毒感染液。待WT 組細(xì)胞被嘌呤霉素全部殺死后，將SLC6A4 干擾組存活下來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6 孔板，繼續(xù)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的陽(yáng)性克隆孔逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得敲減SLC6A4 基因PC12 細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞株。

1.2.5 RT-PCR 法檢測(cè)目的基因SLC6A4 基因的表達(dá)量

總RNA 的提取及其質(zhì)量和濃度的測(cè)定：按照TaKaRa 基因提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因。使用BiowaveⅡ+紫外儀測(cè)定RNA 的濃度。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以cDNA 為模板實(shí)時(shí)熒光定量，將樣品放入-80 ℃冰箱保存。RT 反應(yīng)液反應(yīng)體系：（RT-PCR 引物的合成F， 5'-ACTAGCTGCACGAACTCCTGGAA-3'和R，5'-AGACTGGTGGATCTGCAGGACA-3'），由寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成大鼠mRNA 序列，Realtime RT-PCR 反應(yīng)稀釋引物，配制PCR 反應(yīng)液，將cDNA 和PCR 反應(yīng)液加入八連管后，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中反應(yīng)，2 h 后可得擴(kuò)增和溶解曲線、目的基因的Ct 值。RT-PCR 反應(yīng)條件：第一步：95 ℃、30 s，第二步：95 ℃、5 s；60 ℃、31 s；40 個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR 陽(yáng)性克隆片段測(cè)序，并在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中將測(cè)序出的結(jié)果進(jìn)行Blast 比對(duì)。

1.2.6 Western Blot 檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后目的蛋白5-HTT 的表達(dá)

干擾對(duì)照組（轉(zhuǎn)染 NC-shRNA）、干擾組（轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA）。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3 組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌2次，離心，棄上清液，加入100 μl 預(yù)冷的RIPA 細(xì)胞裂解液，置冰上30 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液并進(jìn)行蛋白定量（BCA 法），加上樣緩沖液煮沸10 min，離心后取50 μg 蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，蛋白半干轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，50 g/L 脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，加入大鼠SLC6A4 的Ⅰ抗，4 ℃孵育過(guò)夜。應(yīng)用TBST 反復(fù)洗膜3 次，加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，將膠片拍照后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

將PC12 細(xì)胞干擾對(duì)照組（轉(zhuǎn)染 NC-shRNA）、干擾組（轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA-2）分為兩組，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞分別以105的密度接種于6 孔板中，24 h 后，更換培養(yǎng)液。將NC-shRNA 組和SLC6A4-shRNA 組細(xì)胞分為正常條件和缺氧條件培養(yǎng)，正常組：置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；缺氧組：將培養(yǎng)皿置于缺氧小室中，混合氣體（體積分?jǐn)?shù)94% N2+體積分?jǐn)?shù)5% CO2+體積分?jǐn)?shù)1%O2）置換其中的空氣，之后將裝置放入37 ℃的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)。24 h 后用4 ℃預(yù)冷的 PBS 洗2 次，去掉殘余培養(yǎng)基，用不含 EDTA 的胰酶消化，室溫下1 500×g離心10 min，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞；用4 ℃預(yù)冷的1×PBS 洗滌細(xì)胞2 次，150×g離心5 min，去上清液，收集細(xì)胞；加入1×結(jié) 合 緩 沖 液 300 μl 懸 浮 細(xì) 胞，調(diào) 整 濃 度 約1×106個(gè) 細(xì) 胞/ml；每100 μl 細(xì) 胞 懸 液 加 入5 μl Annexin V-FITC 混勻，室溫避光孵育15 min；上機(jī)檢測(cè)前5 min，加入5 μl PI 染色；補(bǔ)加400 μl 1×結(jié)合緩沖液輕輕混勻；將細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 SLC6A4-shRNA 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

GV248 與含特定RNAi 靶序列的DNA oligo經(jīng)酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆測(cè)序（圖1）顯示含有正確的RNAi 靶序列，表明shRNA片段已定向插入慢病毒載體質(zhì)粒。重組shRNA 慢病毒載體與慢病毒包裝體系混合后感染293T 細(xì)胞，293T 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈圓形，大小均勻，排列致密整齊，熒光顯微鏡下觀察感染細(xì)胞呈明顯GFP 綠色熒光，感染率超過(guò)90%（圖2）。

2.2 重組慢病毒感染PC12 細(xì)胞及干擾效果的檢測(cè)

圖1 重組慢病毒質(zhì)粒SLC6A4-shRNA-GV248 測(cè)序

圖2 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒感染293T 細(xì)胞GFP 表達(dá)(×200)

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選得到各組的最佳MOI 值， 當(dāng)NC-shRNA 的MOI 值為100、SLC6A4-shRNA-1 的MOI 值為100、SLC6A4-shRNA-2 的MOI 值為20和 SLC6A4-shRNA-3 的MOI 值為50 時(shí)各組PC12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高且細(xì)胞狀態(tài)良好，熒光顯微鏡下可見(jiàn)4 組細(xì)胞GFP 陽(yáng)性表達(dá)，感染率約為80%以上。如圖3 所示，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察重組慢病毒的GFP 綠色熒光，與SLC6A4-shRNA-1 和SLC6A4-shRNA-3 相比，SLC6A4-shRNA-2 感染的PC12 細(xì)胞較其余兩組大小均勻，排列致密整齊，熒光顯微鏡下觀察感染細(xì)胞GFP 綠色熒光更為明顯，細(xì)胞狀態(tài)良好。

通過(guò)RT-PCR 驗(yàn)證各組細(xì)胞SLC6A4 基因表達(dá)情況，如圖4 所示，與正常對(duì)照組和干擾對(duì)照組比較，慢病毒轉(zhuǎn)染組mRNA 表達(dá)量均顯著降低，其中，SLC6A4-shRNA-1 轉(zhuǎn)染組與SLC6A4-shRNA-3 轉(zhuǎn)染組SERT 的mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；SLC6A4-shRNA-2 轉(zhuǎn)染組SLC6A4 的mRNA 表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）。因此，SLC6A4-shRNA-2 可顯著干擾SLC6A4 基因的表達(dá)，在3 個(gè)干擾靶序列中，干擾效率最佳，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SLC6A4-shRNA-2 進(jìn)一步研究。經(jīng)嘌呤霉素壓力篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，Western blot 檢測(cè)目的蛋白5-HTT 表達(dá)見(jiàn)圖5，干擾組（轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA-2）細(xì)胞內(nèi)5-HTT 蛋白條帶明顯減弱（P＜0.01），抑制率在80%以上，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA 和NC-shRNA 的PC12 細(xì)胞成功建立。

圖3 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒感染PC12 細(xì)胞GFP 表達(dá)(×200)A. 干擾對(duì)照組（轉(zhuǎn)染 NC-shRNA）；B.轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA-1；C.轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA-2；D.轉(zhuǎn)染SLC6A4-shRNA-3

圖4 各組SLC6A4-mRNA 的表達(dá)

2.3 沉默SLC6A4 基因?qū)θ毖鮌C12 細(xì)胞凋亡的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SLC6A4 沉默對(duì)缺氧PC12 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖6 所示，干擾對(duì)照組（NC-shRNA 組）細(xì)胞凋亡率（6.30±0.51）較低，缺氧24 h 后細(xì)胞凋亡率（14.24±0.55）明顯提高（P＜0.05）。SLC6A4-shRNA 組凋亡率（7.98±0.12）較PC12 細(xì)胞組無(wú)明顯差異，SLC6A4-shRNA 缺氧組與NC-shRNA缺氧組相比較顯著下降（9.10±0.22，P＜0.05）。說(shuō)明正常條件下干擾SLC6A4 基因?qū)?xì)胞凋亡無(wú)影響，缺氧后沉默SLC6A4 基因的PC12 細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的比例均明顯下降，說(shuō)明干擾SLC6A4 基因可以抵抗缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡。

圖5 沉默 SLC6A4 基因?qū)?PC12 細(xì)胞5-HTT 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

圖6 沉默SLC6A4 基因?qū)θ毖鮌C12 細(xì)胞凋亡的影響

慢病毒載體是在HIV-1 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的基因載體[7]，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞最為有效的工具之一[8-9]。本研究設(shè)計(jì)合成了3 條SLC6A4 的shRNA 序列，分別將其連接在表達(dá)GFP 和嘌呤霉素的GV248 慢病毒載體上，繼而包裝病毒并得到了高滴度的SLC6A4 shRNA 靶向干擾的慢病毒載體。將其感染PC12 細(xì)胞，應(yīng)用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，成功建立了SLC6A4 敲減的PC12 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，目的是高效沉默PC12 細(xì)胞的SLC6A4 基因，進(jìn)而降低5-HTT 的表達(dá)。之后進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和Western blotting 檢測(cè) SLC6A4 mRNA 和5-HTT 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果提示SLC6A4 mRNA 和5-HTT 的表達(dá)被有效抑制，說(shuō)明其能高效沉默SLC6A4 基因。

神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是缺氧導(dǎo)致腦組織損傷發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其發(fā)生受多種促凋亡蛋白的調(diào)控，細(xì)胞凋亡過(guò)程是細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程，受到基因嚴(yán)格調(diào)控[10]。細(xì)胞凋亡過(guò)程的異常在亨廷頓病、阿爾茲海默癥、腦卒中、抑郁癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生理、病理過(guò)程起到關(guān)鍵作用。細(xì)胞在凋亡過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一系列形態(tài)學(xué)變化，包括核固縮、核碎裂、凋亡小體形成以及DNA 特征性片段化、新基因表達(dá)、某些生物大分子合成等生物化學(xué)變化等異常[11-12]。5-HTT 是5-HT 的專(zhuān)屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是5-HT 重?cái)z取回神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行分解代謝的專(zhuān)屬載體，5-HT 不僅介導(dǎo)腦的情緒的調(diào)節(jié)等多種神經(jīng)生理、生化活動(dòng)，而且在調(diào)節(jié)腦血管的舒縮功能及血腦屏障(BBB)的通透性和穩(wěn)定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等多方面均起著極其重要的作用，5-HTT 表達(dá)異常與多種疾病相關(guān)，抗抑郁藥氟西汀的作用靶點(diǎn)是5-HTT[13-14]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，5-HTT 與高原缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓以及高原腦水腫有一定的聯(lián)系[15]，課題組前期研究表明缺氧可誘導(dǎo)PC12 凋亡而且氟西汀可逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷[4，16]，在本研究中通過(guò)構(gòu)建SLC6A4 慢病毒表達(dá)載體并感染PC12 細(xì)胞，抑制SLC6A4 的表達(dá)可以抑制缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞凋亡，與5-HTT 抑制劑氟西汀逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷的結(jié)果一致，說(shuō)明5-HTT 可能是缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡損傷的重要調(diào)控靶點(diǎn)，但尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證確定。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體感染PC12 細(xì)胞，敲低SLC6A4 基因，建立SLC6A4 基因干擾PC12 細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過(guò)檢測(cè)其對(duì)缺氧狀態(tài)下細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)SLC6A4 基因的沉默可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步探究SLC6A4 基因及5-HTT 蛋白的表達(dá)在缺氧致神經(jīng)細(xì)胞損傷中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。