黃瑞玲, 何 晴, 陸芍華, 嚴(yán)夢(mèng)涵, 許麗惠, 王全溪, 黃翠琴, 黃其春[1.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))，福建 福州 50002;2.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 50002；.福建省家畜傳染病與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 龍巖 64012]

雞感染Ⅰ群禽腺病毒4型(Fowladenovirusserotype 4, FAdV-4)后可引起肝炎—心包積液綜合征(HHS)[1].1987年該病首次發(fā)生在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)，隨后在許多地區(qū)廣泛流行起來[2-4].家禽易感染FAdV-4，急性感染后主要出現(xiàn)肌胃糜爛、包涵體肝炎和心包積液等癥狀.2015年以前，對(duì)雞群危害較大的是感染FAdV-4導(dǎo)致的包涵體肝炎.在研究其致病機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FAdV-4感染機(jī)體細(xì)胞時(shí)，其纖維蛋白表面上的突起與細(xì)胞膜接觸，然后進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)行蛋白的合成，隨后病毒核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核進(jìn)行病毒的復(fù)制并裝配成病毒粒子，當(dāng)宿主細(xì)胞崩解時(shí)，新的病毒產(chǎn)生，故肝細(xì)胞核內(nèi)常可見到病毒包涵體[1,5].目前，可以采取觀察內(nèi)包涵體、免疫熒光檢測(cè)抗原等檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)對(duì)禽腺病毒DNA的有效檢測(cè)與鑒定[6].病毒分離鑒定、PCR反應(yīng)及測(cè)序分析、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)等病原學(xué)和血清學(xué)方法是FAdV-4鑒定及感染診斷的常用方法[7-9]，然而對(duì)感染FAdV-4后病雞外周血細(xì)胞、主要血液生化指標(biāo)的研究并不豐富.近年來，該病則表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的肝炎—心包積液綜合征，并對(duì)全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，急需對(duì)該病的致病機(jī)制做進(jìn)一步深入研究.

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)機(jī)體外周血炎癥因子的探究已十分完善.如：孫培靜等[10]研究表明，外周血免疫球蛋白E(IgE)、補(bǔ)體C3和C4的水平與肥胖型支氣管哮喘患兒病情嚴(yán)重程度及肺功能呈正相關(guān)；詹奇等[11]研究表明，在機(jī)體感染丙型肝炎病毒(HCV)后的不同時(shí)期，都會(huì)提高外周血中白介素-2R(IL-2R)和γ-干擾素(IFN-γ)的水平；袁健生等[12]研究表明，感染紅斑狼瘡后，患者外周血中的免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)水平均提高.然而，F(xiàn)AdV-4感染后對(duì)機(jī)體外周血炎癥因子的影響尚不明確，需進(jìn)一步探明.

多種病毒感染后，對(duì)機(jī)體外周血中的免疫球蛋白、炎癥因子和血細(xì)胞均有影響.禽腺病毒感染導(dǎo)致嚴(yán)重的心包炎和肝炎，其致病機(jī)制仍有許多需要進(jìn)一步闡明.本研究主要從外周血角度，探究FAdV-4感染對(duì)雞外周血細(xì)胞、主要血液生化指標(biāo)和炎癥因子的影響，旨在為FAdV-4致病機(jī)理的進(jìn)一步研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和病毒毒株 供試30只28日齡白羽肉雞經(jīng)PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ezyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)為FAdV-4抗原、抗體雙陰性.FAdV-4 NP株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存[13-14]，其半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(tissue culture infective dose, TCID50)=10-4.625·mL-1.

1.1.2 主要試劑 普通真空采血管、EDTA-K2真空采集管、頭皮針等購(gòu)自蘭博利德有限公司；血常規(guī)檢測(cè)試劑盒、血液生化檢測(cè)盒、血液炎癥因子ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒購(gòu)自Promega公司.

1.2 血液樣品的制備

將30只供試雞隨機(jī)分為兩組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只.試驗(yàn)開始時(shí)，試驗(yàn)組每只雞肌肉注射0.5 mL FAdV-4 NP株病毒(TCID50=10-4.625·mL-1)，對(duì)照組每只雞肌肉注射等量的滅菌生理鹽水.于感染3、6、12、24 h時(shí)，從每個(gè)重復(fù)中各取1只雞，采集抗凝和非抗凝外周血.用分離血清后的非抗凝血檢測(cè)血液生化指標(biāo)和炎癥因子；用抗凝血檢測(cè)血細(xì)胞和病毒載量.

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 病毒載量的檢測(cè) 按照病毒RNA提取試劑盒說明書的步驟提取各組病毒RNA樣本，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[15].合成的cDNA保存在-20 ℃.按照SYBR熒光定量試劑盒說明書的步驟進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增.反應(yīng)體系20 μL：10 μL Mix，7.9 μL ddH2O，上、下游引物各0.6 μL，1.5 μL cDNA.qPCR的擴(kuò)增條件為兩步法：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 5 s，循環(huán)40次.以β-actin為內(nèi)參基因，采用陳媛等[15]的方法計(jì)算基因表達(dá)量.引物由上海生工生物技術(shù)公司合成[13].引物信息如表1所示.

表1 熒光定量PCR相關(guān)引物序列

1.3.2 血細(xì)胞的檢測(cè) 用抗凝血液檢測(cè)血細(xì)胞，檢測(cè)指標(biāo)有白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù).采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè).

1.3.3 血液生化指標(biāo)的檢測(cè) 將普通真空采血管中的血液移至EP管中，待血液凝固后，于3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，棄去沉淀.用分離的血清檢測(cè)血液生化指標(biāo)，檢測(cè)指標(biāo)有血糖、甘油三酯、總蛋白等水平.采用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè).

1.3.4 血液炎癥因子的檢測(cè) 檢測(cè)的炎癥因子有人高遷移率族蛋白B1(human high-mobility group box-1, HMGB1)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、組胺、緩激肽、P物質(zhì)等水平.按照TransZol Up Plus RNA試劑盒說明書的步驟提取血液總RNA，按照GoScriptTMReverse反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-qPCR檢測(cè)炎癥因子的水平[13,15].

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 FAdV4感染對(duì)雞外周血細(xì)胞病毒載量的影響

3～24 h時(shí),被FAdV-4感染的時(shí)間越長(zhǎng)，雞外周血細(xì)胞病毒載量越高，二者呈正相關(guān)(圖1).

圖1 FAdV-4感染對(duì)雞外周血細(xì)胞病毒載量的影響

2.2 FAdV-4感染對(duì)雞外周血細(xì)胞的影響

圖2顯示，與未攻毒組相比，隨著被FAdV-4感染的時(shí)間越長(zhǎng)，雞外周血細(xì)胞中的紅細(xì)胞數(shù)相應(yīng)減少，而白細(xì)胞數(shù)則相應(yīng)增加.感染3 h時(shí)，白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)；感染6、12、24 h時(shí)，白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)與未攻毒組的差異顯著(P<0.05).紅細(xì)胞數(shù)與感染時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，而白細(xì)胞數(shù)與感染時(shí)間呈正相關(guān).感染3、6 h時(shí)，雞外周血細(xì)胞中的血小板數(shù)與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染12、24 h時(shí)的血小板數(shù)增加，尤其在12 h時(shí)增加最多，與未攻毒組的差異顯著(P<0.05).

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.3 FAdV-4感染對(duì)雞外周血液生化指標(biāo)的影響

圖3顯示：與未攻毒組相比，感染FAdV-4 3～24 h，雞外周血液中的血糖濃度顯著升高(P<0.05)，甘油三酯濃度顯著下降(P<0.05)，總蛋白含量也減少；總蛋白含量在被FAdV-4感染3、12 h時(shí)與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染6、24 h時(shí)與未攻毒組的差異顯著(P<0.05).

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

2.4 FAdV-4感染對(duì)雞外周血炎癥因子的影響

圖4顯示：感染FAdV-4 3、6、12 h時(shí)，雞外周血液中的HMGB1含量與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染24 h時(shí)顯著增加(P<0.05)；感染3～24 h時(shí)，IL-1β、組胺和緩激肽的含量較未攻毒組顯著增加(P<0.05)；感染6 h時(shí)，IL-6和P物質(zhì)的含量與未攻毒組的差異不顯著(P>0.05)，感染3、12、24 h時(shí)，IL-6和P物質(zhì)的含量均顯著增加(P<0.05).

圖柱上附不同字母表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

2015年后，全球陸續(xù)報(bào)道雞發(fā)生嚴(yán)重的肝炎—心包積液綜合征，經(jīng)證實(shí)病原為FAdV-4，與雞包涵體肝炎不同的是，肝炎—心包積液綜合征導(dǎo)致3～5周齡雞心包腔產(chǎn)生大量的黃色膠凍狀滲出液，肝臟有大量出血點(diǎn)，肝炎嚴(yán)重，肝細(xì)胞變性壞死，肝血竇擴(kuò)張，出現(xiàn)嗜堿性包涵體[1].目前，F(xiàn)AdV-4的致病機(jī)理尚未完全明確.

血常規(guī)包括紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)和血小板計(jì)數(shù)等.血常規(guī)檢查首先可以確定機(jī)體是否存在炎癥、貧血以及是否存在血小板數(shù)減少或者增加的現(xiàn)象，初步判定機(jī)體出血是否與血小板有關(guān)[16].本研究結(jié)果表明：感染FAdV-4后，雞外周血細(xì)胞病毒載量與感染時(shí)間呈正相關(guān)；紅細(xì)胞數(shù)隨著病毒載量的增加而減少，說明感染FAdV-4后機(jī)體有出血或失血現(xiàn)象，此結(jié)果與臨床病理剖檢結(jié)果[13]一致.由于雞感染FAdV-4后有出血癥狀，導(dǎo)致外周血紅細(xì)胞數(shù)減少[17]，雞呈明顯的貧血狀態(tài).雞感染FAdV-4后，其肝臟發(fā)生嚴(yán)重的出血病變，肝臟病變會(huì)影響機(jī)體的凝血功能，導(dǎo)致外周血小板數(shù)增加，使外周血液處于高凝狀態(tài)；此外，趙麗紅[18]研究表明，“肝藏血”功能異常會(huì)導(dǎo)致肝炎患者血紅細(xì)胞數(shù)下降.本研究結(jié)果顯示，感染FAdV-4后，雞外周血白細(xì)胞數(shù)與病毒載量呈正相關(guān)，表明炎癥細(xì)胞顯著增加，此結(jié)果與國(guó)紀(jì)壘[19]的研究結(jié)果“FAV-1攻毒后的24 h內(nèi)白細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組”一致.唐迎元等[20]研究表明，兒童感染重癥腺病毒肺炎后，外周血白細(xì)胞數(shù)和血小板數(shù)增加.有些病毒的感染也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，從而對(duì)機(jī)體造成損傷[17-20].

血液中的總蛋白、血糖、甘油三酯水平可以初步判定機(jī)體肝臟功能[21].研究表明，新冠病毒導(dǎo)致感染者血糖濃度升高，與糖尿病關(guān)系密切[22].由于新冠病毒會(huì)直接破壞胰腺進(jìn)而破壞胰島細(xì)胞[22]，可能引起炎癥因子發(fā)生改變從而導(dǎo)致機(jī)體腎上腺素等分泌增加，產(chǎn)生胰島素抵抗，血糖濃度升高[22].糖皮質(zhì)激素通過抗炎作用阻斷炎癥瀑布反應(yīng)，作為胰島素對(duì)抗激素，引起血糖濃度升高[22].由此猜想，F(xiàn)AdV-4感染是否與新冠病毒感染相同，通過破壞胰腺進(jìn)而引起血糖濃度升高需要進(jìn)一步探究.此外，牛玉娟[23]研究表明，感染FAdV-4 1 d后，雞血糖濃度升高，此結(jié)果與本研究結(jié)果一致.由于肝臟是血糖代謝的主要器官，感染FAdV-4后，雞肝臟功能被破壞，從而導(dǎo)致血糖降解能力減弱，出現(xiàn)血糖濃度升高的現(xiàn)象.本研究結(jié)果同樣表明，感染FAdV-4后，雞血糖濃度顯著升高，可能與肝臟損傷有關(guān).

外周血總蛋白含量減少常見于機(jī)體由于肝細(xì)胞病癥或肝功能受損而引起的蛋白合成障礙.如：徐亞林等[24]研究表明，新冠肺炎明顯損傷患者的肝功能，其中，總蛋白對(duì)于肝功能損傷具有一定程度的診斷價(jià)值；本研究結(jié)果表明，雞感染FAdV-4后，病禽的肝臟呈現(xiàn)嚴(yán)重出血的病理癥狀，導(dǎo)致總蛋白合成障礙，外周血總蛋白含量減少；李碩[25]研究表明，甘油三酯濃度下降可能是雞患有嚴(yán)重的肝病或者機(jī)體代謝異常所導(dǎo)致的.本研究中，雞感染FAdV-4后，肝臟受損嚴(yán)重從而導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，可能是甘油三酯濃度下降的原因.

HMGB1主要的作用是可以激活肥大細(xì)胞從而導(dǎo)致中樞炎癥[26].IL-6是活化的T細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，它的主要功能是能使B細(xì)胞前體產(chǎn)生抗體，還能與集落刺激因子協(xié)同促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，進(jìn)一步增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能[27].HMGB1和IL-6含量的增加可以說明雞感染FAdV-4后機(jī)體炎癥因子釋放明顯[26-27].IL-1β作為內(nèi)皮細(xì)胞活化因子，其主要的作用是在機(jī)體炎癥產(chǎn)生的前期誘導(dǎo)單核—吞噬細(xì)胞的產(chǎn)生[26-27].湯正珍[28]研究表明，小鼠感染HAdV-7 24 h后，HMGB1的表達(dá)量顯著增加.細(xì)胞外的HMGB1與Toll樣受體、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體相結(jié)合從而促使NF-kB通路被激活，進(jìn)一步促進(jìn)致炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β基因表達(dá)水平的上調(diào)，促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生[29].組胺是一種活性胺化合物，是機(jī)體中的一種化學(xué)傳導(dǎo)物質(zhì)，對(duì)許多細(xì)胞的反應(yīng)均有影響，其中就包括過敏反應(yīng)和炎性反應(yīng)[27].馬衛(wèi)紅等[30]研究表明，雞、鴨外周血中的組胺含量在感染病毒后均顯著升高，表明低致病性H9N2禽流感病毒可引起禽類產(chǎn)生炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致組胺含量升高.緩激肽可以提高心肌缺血早期三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸的含量，使糖原分解減少，乳酸生成下降，從而提高心肌的抗缺血能力[26].P物質(zhì)在細(xì)神經(jīng)纖維中廣泛分布，逆向電刺激感覺神經(jīng)或經(jīng)細(xì)傳入神經(jīng)傳出的軸突反射和背根反射沖動(dòng)可使外周端末稍釋放P物質(zhì)，引起神經(jīng)支配區(qū)血管擴(kuò)張、通透性增強(qiáng)、血漿蛋白外滲等神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)[31].P物質(zhì)是傷害性信息初級(jí)傳入的神經(jīng)遞質(zhì)，與許多炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子相互作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而促進(jìn)單核細(xì)胞分泌 IL-1、IL-6等炎癥因子[31].本研究結(jié)果表明，雞感染FAdV-4后導(dǎo)致外周血多種炎癥因子顯著增加，說明與上述前人的研究結(jié)果一致，機(jī)體感染病毒后均會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng).