彭麗鴻, 崔朝偉, 王佳琪, 馬東旭, 任正標, 何宗明, 林開敏

(1.福建農林大學林學院，福建 福州 350002；2.國家林業(yè)和草原局杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002；3.大伊山旅游度假區(qū)管委會,江蘇 連云港 222200)

杉木人工林具有速生豐產、適應性強、經濟效益高等優(yōu)點，在我國南方廣泛種植.但伴隨著杉木人工林純林化、針葉化、集約化和多代連栽現(xiàn)象的日益嚴重，林分生物多樣性降低、水土流失、地力衰退、生產力下降等生態(tài)問題嚴重影響其可持續(xù)發(fā)展[1-2].大量研究[2-5]表明：杉木連栽會造成土壤理化性質惡化或衰退，比如土壤容重增加、土壤通氣以及容蓄能力下降、土壤養(yǎng)分含量下降以及酶活性降低等.土壤微生物作為土壤生物中最重要的組成部分之一，在植物生長、土壤肥力形成和發(fā)展、營養(yǎng)元素循環(huán)等方面發(fā)揮著重要作用[6-7].土壤微生物群落以土壤真菌為優(yōu)勢群落，土壤真菌是調節(jié)生態(tài)系統(tǒng)功能的重要驅動力[8]，如菌根等真菌在提高植物生產力和抗病性以及緩解其他生物和非生物脅迫方面起到重要作用[9-10].腐生真菌占土壤真菌群落的50%以上，通常被認為是主導土壤中有機質降解和養(yǎng)分循環(huán)的主要分解者[11-12].以往的研究主要集中于連栽對人工林土壤理化性質的影響[13-15]，連栽對于杉木人工林表層土壤微生物群落結構與功能類群影響的研究[16-17]較少，尤其是對理化性質和土壤真菌功能類群影響的研究鮮有報道.鑒于此，本研究以福建省南平市峽陽國有林場的杉木林為研究對象，研究杉木連栽對土壤真菌群落結構及功能的影響.利用ITS rRNA高通量測序技術揭示連栽對杉木人工林土壤真菌群落結構、功能及土壤環(huán)境因子的影響，旨在為杉木人工林地力衰退的防治提供參考.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

樣地設置在福建省南平市峽陽國有林場，屬丘陵地帶，年平均氣溫20 ℃，海拔350～700 m，坡度20°～30°；年均降水量1 500～1 600 mm，年均蒸發(fā)量1 300 mm左右，雨季3～6個月；年均相對濕度75.2%，無霜期290 d左右；土壤以紅壤為主，土層中厚[18].林下植被主要有粗葉榕(Ficushirta)、毛冬青(Ilexpubescens)、毛柄短腸蕨(Allamtodiadilatata)、中華里白(Dicranopterischinensis)、觀音座蓮(Angiopterisfokiensis)、江南短腸蕨(Allantodiametteniana)、狗脊(Woodwardiajaponica)等.

1.2 試驗設計

為了保證試驗的準確性，盡量選取坡度、坡向、坡位、立地條件等較為一致的杉木人工林，2020年10月將峽陽國有林場中1967年實生苗造林形成的1代杉木人工林(CK，林齡53 a)和1997年對1代杉木人工林進行采伐后采用傳統(tǒng)杉木栽培技術進行連續(xù)栽植的2代杉木林(TP，林齡23 a)設置為試驗林.樣地設計位置相鄰，立地條件較好，林分地位指數(shù)均為18.

1.3 土壤采集方法

不同代數(shù)杉木林分的不同坡位(上坡、中坡、下坡)分別設置3個20 m×20 m的樣地.在每一個樣地內，按照梅花型挖取5個(0～10 cm)樣地土壤剖面，均勻取土后進行等量充分混合；隨機采集1 kg左右土樣存放于自封袋中，帶回實驗室.土樣分2批保存，部分放入-80 ℃冰箱保存，用于測定土壤真菌多樣性、可溶性碳及硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量；另一部分進行烘干處理，過2 mm篩及0.149 mm篩，用于測定土壤化學性質等.

1.4 數(shù)據(jù)測定與分析

1.4.1 土壤全碳、全氮含量的測定 用碳氮分析儀測定過0.149 mm篩風干土的全碳、全氮含量.

1.4.2 全磷、全鉀含量的測定 采用高氯酸—硝酸—氫氟酸消煮法，消煮液用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(PE OPTIMA 800)測定.

1.4.3 土壤可溶性碳的測定 采用硫酸鉀浸提法測定過2 mm篩的新鮮土壤.

1.4.4 硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的測定 采用氯化鉀浸提—擴散法測定過2 mm篩的新鮮土壤.

1.4.5 微生物群落多樣性分析 從新鮮土樣中提取DNA后，利用帶有barcode的特異引物擴增rDNA的保守區(qū).然后將PCR擴增產物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進行定量分析.將純化的擴增產物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，Hiseq2500 PE250上機測序.采用FLASH軟件對原始數(shù)據(jù)進行質量過濾和雙端序列的拼接，得到有效數(shù)據(jù)[9].采用Uparse軟件，對相似度≥97%的序列歸為1個操作分類單元，即OTU.運用Qiime軟件對所得優(yōu)質序列近物種進行分類分析，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性指數(shù)(Sob指數(shù)、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù))等分析；采用FUNGuild數(shù)據(jù)庫完成對真菌分類信息的注釋[11]；運用R語言進行土壤微生物NMDS分析以及相關性分析.使用Excel對數(shù)據(jù)進行整理以及圖形繪制，采用SPSS 19.0軟件對土壤養(yǎng)分和主要優(yōu)勢微生物的數(shù)據(jù)進行單因素方差(ANOVA)分析，采用獨立樣本T檢驗比較不同處理間的顯著性(P<0.05)，利用Canoco5.0軟件做冗余分析[19].

2 結果與分析

2.1 杉木連栽對土壤養(yǎng)分的影響

對不同林分樣地表層土壤進行理化性質分析，結果見表1.從表1可知：2代林中土壤養(yǎng)分含量整體呈下降趨勢，而全鉀含量有所上升，但并不顯著；全碳、全氮、銨態(tài)氮含量與有機碳含量表現(xiàn)為2代林顯著低于1代林(P<0.05)；全磷含量無明顯變化.說明2代連栽會降低土壤養(yǎng)分含量.

表1 不同代數(shù)杉木人工林土壤的理化性質1)

2.2 杉木連栽對土壤表層真菌多樣性的影響

對所得優(yōu)質序列按≥97%的相似度進行OTU聚類分析后得到了3 820個OTUs，數(shù)據(jù)有效率為91.03%～93.92%；CK和TP得到的有效序列分別為93.67%、92.57%，說明原始數(shù)據(jù)利用率較高，絕大多數(shù)都可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析.對不同林分樣地表層土壤真菌進行Alpha多樣性分析(表2)，Alpha多樣性指數(shù)表現(xiàn)為TP略高于CK，但獨立樣本T檢驗分析結果表明Alpha多樣性分析指數(shù)在連栽前后差異不顯著(P>0.05)，說明TP可能會提高杉木人工林表層土壤真菌豐富度及多樣性，但影響并不顯著(P>0.05).

表2 Alpha多樣性分析指數(shù)1)

2.3 連栽對土壤表層真菌群落相對豐度的影響

通過高通量測序得出，真菌群落在門和種水平物種數(shù)量上的相對豐度表現(xiàn)為TPCK.本研究挑選出不同土壤真菌群落在綱和屬水平上相對豐度均值排名前十的物種，其他已知物種歸為others和未知物種(unclassified)，以此來分析綱水平上連栽對土壤真菌群落物種分布的影響.結果顯示，TP與CK微生物在綱及屬水平上相對豐度排名前十的真菌群落種類相同，但其所占相對豐度有所不同.TP樣地的相對豐度排名前十的綱(從高到低)依次是糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、銀耳菌綱(Tremellomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、古菌綱(Archaeorhizomycetes)、Eudicotyledonae、毛霉菌綱(Mucoromycetes)、被孢霉綱(Mortierellomycetes).TP及CK樣地中微生物糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)均為主要優(yōu)勢真菌綱， 在TP與CK中相對豐度分別為29.14%與56.77%、10.67%與6.25%、9.57%與17.20%.綱水平上主要優(yōu)勢真菌群落種類無明顯變化，相對豐度變化存在差異，但獨立樣本T檢驗結果差異不顯著(圖1a).

在屬水平上真菌群落TP排名前十(從高到低)依次是木霉屬(Trichoderma)、圓孢霉屬(Staphylotrichum)、青霉菌屬(Penicillium)、籃狀菌屬(Talaromyces)、Saitozyma、水曲霉屬(Clonostachys)、擬青霉屬(Purpureocillium)、大青屬(Clerodendrum)、Leohumicola、彎頸霉屬(Tolypocladium).主要優(yōu)勢群落屬在TP與CK上表現(xiàn)為相同屬，但相對豐度存在差異，主要優(yōu)勢群落木霉屬、圓孢霉屬、青霉菌屬在TP及CK中相對豐度占比分別為12.14%與18.89%、6.52%與7.03%、4.75%與13.31%.經獨立樣本T檢驗，發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢真菌群落的相對豐度差異性并不顯著(圖1b).

圖1 土壤真菌群落在綱、屬水平上的相對豐度

2.4 土壤表層真菌群落在綱、屬水平上的多維尺度

為了解連栽對土壤真菌群落組成的差異性，分別對綱(圖2a)、屬(圖2b)水平上土壤真菌群落進行非度量多維尺度(non-metric multidimensional, NMDS)分析.微生物群落組成的差異性是以組間距離來呈現(xiàn)的，差異越大距離越遠，差異越小距離越近.由圖2可知，不論在綱、屬水平上，TP與CK間距離都相近，說明兩者群落組成差異較小，即2代連栽對于表層土壤真菌的群落組成及結構的影響并不明顯.

a.綱水平；b.屬水平.

2.5 土壤真菌群落的功能

對TP及CK土壤真菌群落OTUs進行營養(yǎng)類型功能注解分析(圖3)，共檢測出7種營養(yǎng)類型，分別是病原營養(yǎng)型(pathotroph)、病原—腐生營養(yǎng)型(pathotroph-saprotroph)、病原—腐生—共生營養(yǎng)型(pathotroph-saprotroph-symbiotroph)、病原—共生營養(yǎng)型(pathotroph-symbiotroph)、腐生營養(yǎng)型(saprotroph)、腐生—共生營養(yǎng)型(saprotroph-symbiotroph)和共生營養(yǎng)型(symbiotroph).相對豐度排前三的分別是腐生營養(yǎng)型、病原—共生營養(yǎng)型和病原—腐生營養(yǎng)型真菌；連栽前后腐生營養(yǎng)型真菌豐度無明顯變化，除病原—腐生—共生營養(yǎng)型真菌豐度有所上升外，其他營養(yǎng)類型真菌豐度均出現(xiàn)一定程度的下降.獨立樣本T檢驗結果表明2代杉木林中腐生—共生營養(yǎng)型真菌的平均豐度極顯著低于1代林(P<0.01).對其進行進一步的分類，發(fā)現(xiàn)該功能類群真菌主要優(yōu)勢類群是內生菌—凋落物腐生菌—土壤腐生菌—未定義的腐生菌和外生菌根—未定義腐生菌.這兩類真菌類群的功能主要來源菌屬為Mortierella屬和Myxotrichaceae科.

Path：病原營養(yǎng)型.Pa-Sa:病原—腐生營養(yǎng)型.Pa-Sa-Sy：病原—腐生—共生營養(yǎng)型.Pa-Sy:病原—共生營養(yǎng)型.Sapr:腐生營養(yǎng)型.Sa-Sy:腐生—共生營養(yǎng)型.Symb:共生營養(yǎng)型.

2.6 土壤真菌與理化性質的相關性

對Alpha多樣性指數(shù)(圖4)與土壤化學性質進行RDA分析，結果顯示：第一、二主成分軸分別解釋Alpha多樣性的94%、5.5%.由圖4可知，Sob指數(shù)與全碳、全氮、可溶性有機碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈極顯著負相關；Chao1和Ace指數(shù)與全碳、全氮、可溶性有機碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈極顯著負相關，與全磷含量呈顯著負相關；Shannon和Simpson指數(shù)與全磷呈極顯著負相關，與全碳、全氮、可溶性有機碳、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮呈顯著負相關，與全鉀呈顯著正相關.

圖4 Alpha多樣性指數(shù)與土壤理化性質冗余分析

以土壤化學性質作為解釋變量， 以不同綱、屬水平上TP前6位的優(yōu)勢真菌群為響應變量進行冗余分析(圖5).結果(圖5)顯示，第一、二主成分軸分別解釋綱水平真菌群落組成差異的88.2%、11.3%(圖5a)；解釋屬水平上的土壤真菌群落組成差異的61.7%、19.6%(圖5b).由圖5a可知，糞殼菌綱與全碳、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量呈顯著正相關，與全鉀含量呈顯著負相關；散囊菌綱與全磷含量呈顯著負相關，與有機碳含量呈正相關；座囊菌綱與全碳、全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量呈極顯著負相關；銀耳菌綱與全鉀含量呈極顯著正相關，與硝態(tài)氮含量呈極顯著負相關；傘菌綱與土壤全碳、全氮、銨態(tài)氮含量呈極顯著負相關；錘舌菌綱與有機碳含量呈極顯著負相關.如圖5b所示，木霉屬與全碳、全氮、銨態(tài)氮、有機碳含量呈顯著正相關；擬青霉屬與全磷含量呈極顯著負相關，與有機碳含量呈顯著正相關；圓孢霉屬與硝態(tài)氮呈顯著負相關；籃狀菌屬與硝態(tài)氮呈極顯著負相關；水曲霉屬與硝態(tài)氮呈顯著正相關；Saitozyma與全鉀呈極顯著正相關，與全碳、全氮、銨態(tài)氮呈顯著負相關.

a.綱水平；b.屬水平. Sordario：Sordariomycetes；Eurotiom：Eurotiomycetes；Dothideo：Dothideomycetes；Tremello:Tremellomycetes；Leotiomy:Leotiomycetes；Agaricom:Agaricomycetes. Trichode:Trichoderma；Penicill:Penicillium；Staphylo:Staphylotrichum；Talaromy:Talaromyces；Clonosta：Clonostachys；Saitosta：Saitozyma.

以土壤化學性質作為解釋變量，以不同營養(yǎng)類型真菌群落為響應變量進行RDA分析(圖6).結果(圖6)顯示，第一、二主成分軸分別解釋不同營養(yǎng)類型真菌群落差異的71.5%、21.1%.其中病原營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型以及腐生—共生營養(yǎng)型真菌與有機碳含量呈極顯著正相關關系，與全磷含量呈極顯著負相關；病原—共生營養(yǎng)型真菌與全磷含量呈極顯著負相關，與有機碳含量呈顯著正相關；病原—腐生—共生營養(yǎng)型真菌與全碳、全氮、全鉀、銨態(tài)氮含量呈極顯著負相關，與有機碳含量呈顯著負相關，與全磷、全鉀含量呈正相關；腐生營養(yǎng)型真菌與全鉀含量呈極顯著正相關，與全磷、硝態(tài)氮含量呈顯著負相關；病原—腐生營養(yǎng)型真菌與硝態(tài)氮呈顯著正相關，與全磷、全鉀含量呈顯著負相關.

Sapr:腐生營養(yǎng)型.Path:病原營養(yǎng)型.Symb:共生營養(yǎng)型.Pa-Sa:病原—腐生營養(yǎng)型.Pa-Sy:病原—共生營養(yǎng)型.Sa-Sy:腐生—共生營養(yǎng)型.Pa-Sa-S:病原—腐生—共生營養(yǎng)型.

3 討論與小結

本研究發(fā)現(xiàn)杉木人工林2代連栽會導致表層土壤全碳、全氮、銨態(tài)氮以及有機碳含量顯著降低.連栽會導致土壤質量下降，對土壤養(yǎng)分含量及利用效率產生不同程度的影響.呂小燕等[20]和馬祥慶等[13]認為土壤有機碳和全氮含量會隨著連栽代數(shù)的增加而顯著下降，這與本文研究結論一致.土壤微生物群落的豐富度及多樣性對土壤狀況的改變十分敏感，因此微生物群落變化可以作為反映土壤狀況的指標之一[21].土壤微生物群落結構和組成在決定生態(tài)系統(tǒng)功能方面具有重要作用，尤其是有機質的轉化和養(yǎng)分循環(huán)方面[22].本研究中，連栽對土壤表層真菌豐富度的影響與大多數(shù)研究結果[23-24]基本一致.2代杉木連栽可以在一定程度上提高表層土壤真菌豐富度，但影響程度并不顯著.劉麗等[25]和王士亞[26]在對杉木人工林的研究中均發(fā)現(xiàn)3代連栽會造成土壤真菌多樣性顯著降低，而2代連栽對土壤真菌群落結構及多樣性無顯著影響，這與本研究結論一致.本研究結果表明連栽對表層土壤真菌alpha多樣性指數(shù)無顯著影響.前人在對杉木人工林的研究中發(fā)現(xiàn)，主要優(yōu)勢綱為散囊菌綱和糞殼菌綱[27].本研究發(fā)現(xiàn)杉木人工林1代林與2代林中的主要優(yōu)勢綱群落均為糞殼菌綱、散囊菌綱和座囊菌綱，主要優(yōu)勢屬群落均為木霉屬、圓孢霉屬、青霉菌屬.2代連栽對于優(yōu)勢菌群種類無顯著影響，糞殼菌綱和散囊菌綱群落的相對豐度在連栽后有所下降，座囊菌綱群落豐度有所上升.糞殼菌綱真菌群落與散囊菌綱真菌群落均可以形成植物菌根，在幫助林木養(yǎng)分吸收方面具有重要作用[28-30]，2代連栽在一定程度上可能會降低土壤養(yǎng)分的利用效率.獨立樣本T檢驗發(fā)現(xiàn)2代連栽對土壤真菌的組成及豐度影響并不顯著，多維尺度分析表明2代連栽對綱、屬水平上真菌群落組成與結構的影響并不顯著.本研究結果表明2代連栽對表層土壤真菌在綱、屬水平上優(yōu)勢菌群落組成、相對豐度以及結構的影響并不顯著.

高尚坤[31]在馬尾松不同營林措施土壤微生物群落特征影響的研究中發(fā)現(xiàn)腐生營養(yǎng)型真菌豐度在重度采伐及除灌后顯著下降，而本研究發(fā)現(xiàn)2代連栽在一定程度上提高了腐生營養(yǎng)型真菌群落豐度，但影響并不顯著.這可能與研究背景有關，高尚坤[31]的研究是在實施不同措施后第2年進行取樣研究，除灌和采伐對土壤環(huán)境造成干擾，從而改變了腐生菌的營養(yǎng)來源.而本研究是2代林生長23 a后進行取樣，采伐對土壤環(huán)境的干擾可能隨著營林年限的增長而恢復；也可能因取樣季節(jié)、林下植被、樹種以及土地利用方式等不同而不一致[32-34].羅楊等[35]在對3代杉木連栽土壤根際鐮刀菌屬的研究中發(fā)現(xiàn)連栽會改變鐮刀菌屬的多樣性，表現(xiàn)為先降低后升高的變化趨勢，而本研究發(fā)現(xiàn)病原營養(yǎng)型真菌群落受2代連栽的影響并不顯著，這可能與真菌功能類群劃分差異有關.本研究發(fā)現(xiàn)，杉木人工林土壤2代連栽會導致腐生—共生營養(yǎng)型功能類群真菌群落的豐度極顯著降低.腐生—共生營養(yǎng)型真菌的營養(yǎng)方式與土壤環(huán)境以及寄主植物的生長狀態(tài)密切相關，通過寄主植物的健康狀況和土壤環(huán)境選擇不同的營養(yǎng)方式[36]，連栽可能導致土壤養(yǎng)分發(fā)生改變，土壤環(huán)境的改變導致該功能類群真菌向腐生營養(yǎng)型轉化.該功能群落以內生菌—凋落物腐生菌—土壤腐生菌—未定義的腐生菌(主要真菌來源是Mortierella屬)和外生菌根—未定義的腐生菌—木材腐生菌(主要真菌來源是Myxotrichaceae科)為主.據(jù)報道，Mortierella屬在降解芳烴和分解植物凋落物方面具有重要作用[37]，Myxotrichaceae科真菌對纖維素以及可溶性酚類物質具有較好的降解作用[38].從土壤真菌功能類群變化情況來看，連栽可能會分解植物凋落物、纖維素等，導致真菌群落豐度降低，進而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)速率和林木養(yǎng)分的吸收速率.

本研究結果表明：2代連栽對杉木人工林表層土壤真菌多樣性的影響并不顯著；對土壤主要優(yōu)勢菌群落種類、相對豐度以及群落結構的影響也不顯著.共發(fā)現(xiàn)7種營養(yǎng)型功能類群，分別是腐生營養(yǎng)型、病原營養(yǎng)型、共生營養(yǎng)型、病原—腐生營養(yǎng)型、病原—共生營養(yǎng)型、腐生—共生營養(yǎng)型以及病原—腐生—共生營養(yǎng)型.其中腐生營養(yǎng)型真菌為主要功能類群，二代連栽對該營養(yǎng)類群真菌無顯著影響，但會導致腐生—共生營養(yǎng)型功能類群真菌群落豐度極顯著降低.土壤真菌多樣性受土壤碳、鉀元素含量的影響更大，豐富度受氮、磷元素的影響更大；腐生營養(yǎng)型真菌與全鉀含量呈顯著正相關，腐生—共生營養(yǎng)型真菌與有機碳含量呈極顯著正相關，與全磷呈極顯著負相關關系.2代連栽可能會降低植物凋落物、纖維素等分解速率，導致土壤養(yǎng)分循環(huán)速率降低.