潘佳亮, 王巧申, 李長強, 李理櫟, 姚洪錫, 閻 合

(1.國家林業(yè)和草原局生物災害防控中心/林業(yè)有害生物監(jiān)測預警國家林業(yè)和草原局重點實驗室,遼寧 沈陽 110034；2.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江 哈爾濱 150040；3.榮成市國有成山林場，山東 榮成 264300)

松材線蟲病(pine wilt disease, PWD)是由病原松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的重大森林病害[1-3].該病害自1982年首次在我國南京市中山陵風景區(qū)發(fā)現(xiàn)以來，迅速傳播蔓延，目前已擴散至我國19個省(自治區(qū)、直轄市)731個縣級行政區(qū)，侵染111.46萬hm2松林，僅2020年就造成近2 000萬株松樹死亡，造成的經濟損失數(shù)以億計[4-5].目前,防治松材線蟲病的方法主要包括嚴格實行檢疫、清理病死樹、化學藥劑毒殺媒介昆蟲松墨天牛(Monochamusalternatus)和病原松材線蟲、培育抗病樹種等[2].但有關松材線蟲的致病機制尚不明確.

類毒液過敏原蛋白(venom allergen-like protein, VAP)是一類在動物和植物線蟲體內廣泛存在的分泌蛋白家族.研究表明，植物寄生線蟲食道腺細胞分泌物在線蟲侵染寄主植物組織早期起到了十分重要的作用，編碼此類分泌蛋白的基因被認為是線蟲的致病基因[6-7].VAP基因參與線蟲與寄主植物的互作過程，目前學者們已完成了大豆包囊線蟲(Heteroderaglycines)[8]、馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchusdestructor)[9-10]、南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)[11-12]、花生莢線蟲(D.africanus)[13]、松材線蟲[14-15]等植物寄生線蟲體內部分相關基因的鑒定.Kang et al[16]研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲分泌的VAP基因與其遷移行為顯著相關，這表明VAP基因可能參與調控松材線蟲在寄主松樹內的早期寄生行為. Wilbers et al[17]研究發(fā)現(xiàn),動物和植物寄生線蟲和自由生活線蟲VAP基因無明顯區(qū)別，且均具有約15 ku富含半胱氨酸的CAP(代謝產物活化蛋白，catabolite activator protein)結構域，可能是VAP的穩(wěn)定分子支架.馮宇倩等[18]對4個Bx-VAPs功能和結構進行初步分析，發(fā)現(xiàn)Bx-VAPs均具有SCP(精子包被蛋白，sperm-coating protein)結構域，屬于SCP/TAPS蛋白(精子包被蛋白的Tpx-1/Ag-5/Pr-1/Sc-7, sperm-coating protein/Tpx-1/antigen-5/pathogenesis related-1/Sc-7).

本研究基于隱桿線蟲屬線蟲VAP基因的相關報道，篩選鑒定出了14個松材線蟲VAP家族成員(Bx-VAPs)蛋白同源序列，并對其生物信息學特性進行分析預測，旨在為進一步研究松材線蟲其余基因的功能和VAP在松材線蟲寄生過程中的作用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 Bx-VAPs基因篩選鑒定及理化特性測定

在NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載了隱桿線蟲屬線蟲(Caenorhabditisbriggsae、C.elegans、C.remanei)的全部VAP基因，以隱桿線蟲屬VAP家族氨基酸序列作為檢索對象，通過Wormbase數(shù)據(jù)庫(https://wormbase.org)[19]與松材線蟲的基因組數(shù)據(jù)[20]進行BLAST比對，篩選出松材線蟲VAP同源序列.

利用ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)[21]對Bx-VAPs的氨基酸數(shù)、相對分子質量、理論等電點、脂肪指數(shù)、分子結構式、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質進行分析，然后通過CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)[22]對Bx-VAPs 保守結構域進行預測.應用Mega 7軟件中的鄰位連接(neighbor-joining, NJ)法構建Bx-VAPs的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，然后再使用bootstrap法驗證樹的可靠性并給出一棵自展一致樹(bootstrap consensus tree)，自展重復抽樣檢驗達1 000次[23].

1.2 蛋白質序列基序分析

Bx-VAPs蛋白基序可以先通過MEME工具(https://meme-suite.org/meme/)[24]進行分析預測，再通過Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)[25]和InterPro數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)[26]進行注釋.

1.3 疏水性和跨膜螺旋區(qū)域分析

應用ProtScale工具(https://web.expasy.org/protscale/)[27]預測Bx-VAPs疏水性；應用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和PSORTb(http://www.psort.org/psortb/)對Bx-VAPs跨膜螺旋區(qū)進行分析[28]；通過Protter網站(http://wlab.ethz.ch/protter/start/)預測Bx-VAPs的拓撲異構模型[29].

1.4 磷酸化位點分析

應用NetPhos 3.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[30]對Bx-VAPs的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸的磷酸化位點數(shù)量進行分析.

1.5 二級結構預測及三級結構建模

應用SOPMA工具(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)[31]預測Bx-VAPs的二級結構；通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)[32]對Bx-VAPs三級結構進行建模.

2 結果與分析

2.1 Bx-VAPs基因的鑒定及理化性質

基于Wormbase數(shù)據(jù)庫比對篩選的結果見表1，在松材線蟲全基因組中找到與其他線蟲VAP同源的基因共14個，將其依次命名為BXY-VAP1～BXY-VAP14.

表1 Bx-VAPs與其他線蟲VAP對照表

由表2可見，不同Bx-VAPs氨基酸數(shù)量差異顯著，區(qū)間為175～295個，平均氨基酸數(shù)量為221.79個.Bx-VAPs相對分子質量為19 449.19～30 731.72，平均為24 493.77.這14個基因的蛋白質理論等電點為4.29～9.40，脂肪系數(shù)為56.07～82.40，表明Bx-VAPs的熱穩(wěn)定性存在顯著差異.蛋白質親水系數(shù)均為負值，分布在-0.682～-0.070之間，說明14個Bx-VAPs基因均為疏水蛋白.這14個蛋白質均由C、H、N、O和S 5種原子組成，原子總數(shù)分布在2 693～4 216個之間.蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為19.62～54.71，其中11種Bx-VAPs的不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，表明蛋白質結構穩(wěn)定，而BXY-VAP3、BXY-VAP8和BXY-VAP9的結構穩(wěn)定性差.

表2 Bx-VAPs理化性質

2.2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹及蛋白質基序

由圖1可見，松材線蟲VAP1、VAP2、VAP3、VAP13聚為一支，VAP10、VAP11和眼線蟲(Loaloa)VAP聚為一支，VAP6、VAP7、VAP8、VAP14聚為一支，VAP4和VAP9聚為一支，VAP5和VAP12聚為一支，同一支上的蛋白可能表現(xiàn)相似的功能.

BXY、LOAG、CE、CRE、CBR分別表示松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、眼線蟲(Loa loa)、秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)、C.remanei、C.briggsae.

14個Bx-VAPs基因家族都含有保守基序2和基序4，表明這兩個基序在松材線蟲VAP家族中保守；進化關系相近的Bx-VAPs含有相同或相似的蛋白質基序，如基序6和基序7都僅存在于BXY-VAP6、BXY-VAP7、BXY-VAP14中(圖2).對獲得的10個保守的蛋白質基序在Pfam和InterPro上進行注釋，發(fā)現(xiàn)所有序列均為CAP家族成員，基序1和基序2為CAP結構域，其他基序未獲得注釋結果.

圖2 Bx-VAPs的蛋白質基序示意圖

2.3 蛋白質疏水性及跨膜螺旋區(qū)分析

Bx-VAPs包含多個親水性和疏水性區(qū)域，其聚集現(xiàn)象并不顯著.以BXY-VAP2為例，其第 194位精氨酸(R)的疏水性分值低(-2.867)，表明其具有很高的親水性；但第8位亮氨酸(L)的疏水性分值較高(1.733)，表明具有疏水性(表3).進一步通過TMHMM對蛋白質序列分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員除VAP5和VAP11外，均屬于胞外蛋白，且不存在跨膜運輸結構.

表3 Bx-VAPs疏水性分析1)

2.4 拓撲異構模型預測

由表4可見，14個Bx-VAPs的氨基酸數(shù)量相近，分布在175～295個之間，蛋白質結構上含有0～5個N-糖基化位點，蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)數(shù)量差異較大，酪氨酸(Y)數(shù)量接近.其中，BXY-VAP2具有5個N-糖基化位點，BXY-VAP3、BXY-VAP4、BXY-VAP11、BXY-VAP13、BXY-VAP14均具有3個N-糖基化位點(圖3).研究證明，N-糖基化位點對蛋白質的折疊和運輸起重要作用[33]，從側面說明Bx-VAPs具有分泌蛋白的特性.此外，BXY-VAP5和BXY-VAP11沒有信號肽，因此，除這兩個蛋白以外均為分泌蛋白.

表4 Bx-VAPs拓撲結構分析

2.5 二級結構分析及三級結構建模

通過對Bx-VAPs二級結構進行分析(表5)發(fā)現(xiàn)，14個Bx-VAPs蛋白質的組成結構不同，其中，無規(guī)則卷曲(32.95%～56.57%)、α-螺旋(16.57%～47.73%)和β-折疊(10.84%～21.71%)3種結構的占比較高，β-轉角(1.47%～11.83%)結構的占比較低.因而推測Bx-VAPs二級結構中無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊起決定作用.三級結構建模結果(圖4)表明，松材線蟲VAP1、VAP3、VAP4、VAP6、VAP7、VAP12和VAP14結構相似，而VAP2、VAP5、VAP8、VAP10和VAP13結構相似.結合蛋白拓樸結構分析發(fā)現(xiàn)，除VAP5和VAP11外，其他Bx-VAPs三級結構均有明顯的胞外蛋白形態(tài)特征.

表5 Bx-VAPs中構成蛋白質二級結構的氨基酸數(shù)量分析

3 討論

VAP作為一種高度保守的線蟲分泌物，可以抑制受傷的寄主植物組織激活自身防御系統(tǒng)，從而調節(jié)寄主植物因寄生線蟲危害而產生的免疫應答[34].研究表明，在寄生線蟲各寄生階段VAP基因表達均發(fā)生特異性上調[35-38].本研究利用生物信息學方法預測了松材線蟲VAP家族成員結構，可為進一步從分子生物學水平上揭示松材線蟲的致病機制奠定基礎.

線蟲在寄生過程中VAP在結構上相對保守，植物和動物寄生線蟲VAP基因序列無顯著差異[17].因此，可以利用已知線蟲的VAP基因定位其他線蟲的VAP基因，進而對其功能進行驗證.本研究基于隱桿線蟲屬線蟲的基因共鑒定到14個松材線蟲VAP家族基因，盡管不同Bx-VAPs氨基酸組成數(shù)量、相對分子質量存在很大的差異，但在進化上相對保守，與其他線蟲[17]相似.

線蟲VAP家族被歸類為SCP/TAPS蛋白，其核心是一個結構保守的約15 ku富含半胱氨酸的CAP結構域，具有類似α-β-α的三明治結構，其保守、穩(wěn)定的結構特性有利于不同種類線蟲對寄主免疫應答的調節(jié)[8,39-41].本研究中，α-螺旋和β-折疊是松材線蟲VAP家族成員的重要組成部分，且所有蛋白均含有CAP結構域，具有明顯的胞外蛋白形態(tài)特征，該結構可能是松材線蟲調節(jié)寄主免疫應答的重要功能位點.

線蟲侵入動物和植物后，會在宿主組織中遷移、繁殖，并以宿主細胞為食，對宿主造成嚴重損害[42-43].在此過程中，線蟲會通過調節(jié)宿主的免疫應答過程而限制宿主對其造成的傷害，創(chuàng)造適合自身生存的環(huán)境[42,44-45]，VAP在其中發(fā)揮著重要的作用.然而，目前針對松材線蟲VAP家族的研究較少.未來應該從松材線蟲和寄主植物兩個方面加強對VAP家族的研究，為明確松材線蟲入侵機制和開展植物抗性育種工作奠定基礎.