龍 健，周昌園，田 力,3，涂 星,3，胡雪黎,3，時嘉琪，劉 丹，聶 娟,3，劉可云，楊 寶,3*

1.湖北民族大學醫(yī)學部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學化學與環(huán)境工程學院(湖北 恩施 445000) 3.湖北民族大學 武陵山中藥材檢驗檢測中心(湖北 恩施 445000)

竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖，收載于《土家族藥物志》和2020版《中國藥典》，是恩施地區(qū)的道地藥材，藥用功能類似三七和人參，甘、微苦，性溫，歸肝、脾、肺經，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補虛強壯的功效，常用于病后虛弱，勞嗽咯血，跌撲損傷等[1-2]?，F代植物化學和藥理學研究表明[3-7]竹節(jié)參富含三萜皂苷類和糖類成分，另含少量的氨基酸類和揮發(fā)油類成分，其中總皂苷部位具有較好的降血脂、降血糖、抗脂肪肝、減肥活性。

中藥化學成分的復雜性和多樣性是其發(fā)揮藥效的基礎，同時也是其質量評價與控制的難點，建立含量測定標準時應盡可能較為全面地反映其內在質量。2020版《中國藥典》竹節(jié)參含量測定項下是以竹節(jié)參皂苷V和竹節(jié)參皂苷Ⅳa作為質控成分，這只是對其質量控制的最基本要求，尚不能較為全面地反映其化學成分的復雜性和多樣性[2]。針對竹節(jié)參化學成分特點，且總皂苷是其主要活性部位，建立多皂苷類成分同時測定的方法更具有整體性和實用性。目前竹節(jié)參指標成分含量測定的方法主要有液相色譜法[2，8]、液相色譜-串聯質譜法[9]。相比于上述方法，超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法(UPLC-Q/TOF-MS)的分辨率和靈敏度更高，在定量分析的同時還能夠根據精確分子量確證?？紤]到竹節(jié)參皂苷類成分的結構相似度較高，普通液相色譜分離較為困難，UPLC-Q/TOF-MS更加適合其定量分析。

本實驗首先報道了一種快速制備竹節(jié)參總皂苷部位的方法，其總皂苷的含量高達84.1%。在此基礎上建立了測定竹節(jié)參及其總皂苷部位中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd含量的UPLC-Q/TOF-MS方法，以期更加快速和全面地對其進行質量分析和控制。

1 儀器與材料

1.1儀器Acquity UPLC超高效液相色譜儀、Xevo G2-XS Q/TOF型質譜儀、UNIFI數據處理軟件、Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，美國Waters公司；梅特勒ME204分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TD5A-WS型離心機，湖南相儀實驗儀器開發(fā)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

1.2材料對照品20S-人參皂苷Rbl(批號MUST-20060101)、20S-人參皂苷Rd(批號MUST-20072210)均購于成都曼思特生物科技有限公司。對照品20S-人參皂苷Rb2(批號wkq21062404)、20S-人參皂苷Rb3(批號wkq21062405)、竹節(jié)參皂苷IV(批號wkq21052810)、20R-人參皂苷Rh1(批號wkq21090609)、20S-人參皂苷Rg2(批號111779-200801)均購于四川省維克奇生物科技有限公司。對照品竹節(jié)參皂苷V(批號111903-202106)、20S-人參皂苷Re(批號110754-202129)、20S-人參皂苷Rf(批號111719-201806)、20S-人參皂苷Rg1(批號110703-202034)、竹節(jié)參皂苷IVa(批號111861-201102)均購于中國食品藥品檢定研究院。對照品擬人參皂苷RT1(批號J24GB155864)購于上海源葉生物科技有限公司。質譜級乙腈、甲醇購自德國Merck公司；色譜級甲酸購自上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。9批次(S1～S9)竹節(jié)參藥材采集于湖北省宣恩縣，經湖北民族大學涂星講師鑒定為五加科植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1竹節(jié)參乙醇提取物及總皂苷的制備竹節(jié)參干燥藥材2.8 kg(同含量測定實驗S3批次)，粉碎成粗粉后用乙醇(37 L)滲濾提取，提取液濃縮干燥后即得605 g乙醇提取物(TQ)。取417 g乙醇提取物經大孔樹脂分離，依次用蒸餾水(25 L)、20%乙醇-水(25 L)、80%乙醇-水(30 L)和95%乙醇-水(25 L)洗脫，回收80%乙醇-水部分洗脫液即得222 g竹節(jié)參總皂苷(TS)，測得竹節(jié)參乙醇提取物和總皂苷部位中總皂苷的含量分別為49.2%和84.1%。

2.2供試品溶液的制備取9批次竹節(jié)參藥材及“2.1”項下竹節(jié)參乙醇提取物和總皂苷部位粉末約0.2 g，加60%甲醇25 mL，密塞，稱量，室溫下超聲處理40 min，冷卻至室溫，再稱量，用60%甲醇補足差量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過。取0.5 mL竹節(jié)參藥材濾液，用60%甲醇分別稀釋40倍和1 000倍作為供試品溶液；取0.5 mL竹節(jié)參乙醇提取物濾液，用60%甲醇分別稀釋80倍和2 000倍作為供試品溶液；取0.5 mL竹節(jié)參總皂苷部位濾液，用60%甲醇分別稀釋125倍和4 000倍作為供試品溶液。

2.3對照品溶液的制備分別精密稱取人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd對照品適量，用色譜甲醇配置成質量濃度為1.29、1.25、0.69、1.06、0.95、1.21、1.01、0.78、1.03、1.03、1.05、0.95、1.05 mg/mL的單一對照品儲備液。精密吸取上述單一對照品儲備液適量，用甲醇配制成質量濃度依次為1 000、1 000、1 000、1 000、1 000、1 000、2 500、1 000、1 000、1 000、1 250、2 500、500 ng/mL的混合對照品儲備液。

2.4色譜質譜條件

2.4.1 色譜條件 Waters UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)。乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脫，0～3.0 min，15%～25%A；3.0～5.0 min，25%～29%A；5.0～11.0 min，29%～35%A;11.0～15.0 min，35%～75%A。流速0.4 mL/min，進樣量1.5 μL，柱溫40℃。

2.4.2 質譜條件 Waters Xevo G2 Q-Tof質譜儀，ESI負離子模式采集數據，毛細管電壓-2.5 kV，錐孔電壓-40 V，脫溶劑氣溫度550℃，脫溶劑氣流量900 L/h，掃描范圍m/z 400～1 200，用亮氨酸腦啡肽實時校正質量軸，采用一級質譜定量，具體定量參數見表1。13個成分在混合對照品和樣品中的定量離子色譜圖見圖1，結果表明樣品測定無明顯干擾，該方法專屬性良好。

表1 13個成分的質譜參數

2.5方法學考察

2.5.1 線性關系考察 取“2.3”項下混合對照品儲備液，用色譜甲醇稀釋為系列質量濃度的標準曲線工作液，按上述色譜質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以峰面積(Y)對待測物濃度(X)做線性回歸，得到回歸方程和相關系數，并以S/N=10計算定量下限(LOQ)，見表2。

表2 回歸方程、相關系數、線性范圍

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，按上述色譜質譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為1.07%、1.52%、0.99%、1.12%、0.91%、1.71%、0.99%、1.08%、1.68%、1.45%、1.20%、1.39%、1.65%，表明儀器的精密度良好。

注：1：人參皂苷Re；2：人參皂苷Rd；3：人參皂苷Rg1；4：人參皂苷Rf；5：人參皂苷Rg2；6：人參皂苷Rh1；7：人參皂苷Rb1；8：竹節(jié)參皂苷V；9：人參皂苷Rb2；10：人參皂苷Rb3；11：擬人參皂苷RT1；12：竹節(jié)參皂苷IV；13：竹節(jié)參皂苷IVa；A：對照品；B：樣品。圖1 化合物1-13的提取離子流圖(負離子模式)

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液(S3)，按上述色譜質譜條件分別在0、2、4、8、12、24、48 h進樣，記錄峰面積。人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd峰面積的RSD分別為1.32%、1.92%、1.37%、1.11%、1.37%、1.75%、0.98%、1.81%、1.75%、1.68%、1.39%、1.73%、1.77%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取同一批樣品(S3)6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜和質譜條件進樣分析，結果顯示樣品中人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd的平均含量分別為5.54、4.19、0.90、0.19、0.04、2.01、88.12、0.04、1.42、0.12、52.77、8.60、0.53 mg/g。RSD分別為1.68%、1.71%、1.02%、1.76%、1.14%、1.98%、0.75%、1.55%、1.46%、0.49%、1.51%、1.78%、0.77%，表明方法的重復性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批次竹節(jié)參樣品(S3)6份，0.1 g，精密加入13個成分的對照品溶液適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜和質譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd的平均加樣回收率分別為98.96%、98.45%、99.33%、97.57%、100.86%、100.45%、99.83%、99.22%、97.50%、100.29%、99.24%、100.05%、97.27%，RSD分別為2.68%、1.95%、2.15%、1.86%、2.25%、1.88%、2.79%、2.46%、2.01%、2.99%、0.91%、1.08%、1.21%，表明該方法準確度良好。

2.5.6 樣品含量測定 稱取9批竹節(jié)參藥材、1批次竹節(jié)參乙醇提取物、1批次竹節(jié)參總皂苷，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，通過回歸方程計算含量，見表3。9批竹節(jié)參藥材中13個成分含量的熱圖見圖2。

表3 樣品含量測定結果(n=3,mg/g)

圖2 9批次竹節(jié)參藥材中13種成分含量熱圖

3 討論

3.1指標成分的選擇三萜皂苷類是竹節(jié)參中的主要成分，具有較好的降血脂、降血糖、抗脂肪肝活性。目前從竹節(jié)參中已分離鑒定了110多個三萜皂苷類成分，多數是以齊墩果酸、人參二醇、人參三醇為基本母核，連接一至數個配糖基形成的苷類[3]。課題組采用UPLC-Q/TOF-MSe技術結合UNIFI分析平臺對竹節(jié)參的化學成分進行了全面分析，結果表明人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rb1、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Rb2、擬人參皂苷RT1、人參皂苷Rb3、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa、人參皂苷Rd在各批次樣本中的含量較高，且無明顯干擾。藥理學研究表明[4，10-11]竹節(jié)參皂苷Ⅴ、擬人參皂苷RT1、竹節(jié)參皂苷Ⅳ、竹節(jié)參皂苷Ⅳa、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re等均具有較好的生物活性。因此，本研究選擇以上13種成分作為竹節(jié)參藥材多成分含量測定的指標成分。

3.2色譜及質譜條件優(yōu)化本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時對樣品中各色譜峰形及分離度的影響，特別是針對竹節(jié)參中多對同時存在的R和S構型人參皂苷類成分，結果表明乙腈-0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫時，可在較短時間內分離各化合物。13個指標成分在ESI源負離子檢測模式下的響應明顯高于正離子模式，主要形成[M-H]-準分子離子峰和[M+HCOO]-加合離子峰，在上述色譜和質譜條件下[M+HCOO]-加合離子峰的響應更高且信號較為穩(wěn)定。因此，本實驗選擇了[M+HCOO]-加合離子峰作為定量離子。

3.3指標成分的含量分析如表3和圖2所示，13種成分在9批次竹節(jié)參藥材中的含量范圍依次為0.70～7.71、0.77～10.77、0.07～1.23、0.06～1.08、0.01～2.97、0.75～5.04、43.99～95.06、0.02～0.08、0.49～27.86、0.05～0.22、18.74～61.40、2.40～30.83、0.03～1.74 mg/g，除竹節(jié)參皂苷V(人參皂苷Ro)、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa外，其余10種成分的含量相對較低。不同批次間13個指標成分含量差異較大，可能與種質資源、種植環(huán)境、種植方式和生長年限有關。2020年版《中國藥典》規(guī)定竹節(jié)參中含竹節(jié)參皂苷V和竹節(jié)參皂苷Ⅳa分別不得低于15.0 mg/g，本研究中僅S5批次兩種指標成分的含量符合規(guī)定，合格率僅為11.1%。其余8批次僅竹節(jié)參皂苷V的含量符合標準(遠高于15.0 mg/g)，竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量均未達標，這與其他單位檢測宣恩產竹節(jié)參的結論基本一致。

竹節(jié)參主要生長于高海拔地區(qū)，目前野生資源儲量不多[3,12]。為了滿足藥用需求，研究人員對竹節(jié)參野生品種進行低海拔山區(qū)馴養(yǎng)或轉家養(yǎng)，生長環(huán)境的改變以及種質資源的優(yōu)劣不可避免地會影響竹節(jié)參皂苷Ⅳa的含量。宣恩地區(qū)為提高竹節(jié)參的品質，應該優(yōu)化其種質、種植環(huán)境、田間管理以及采收時間。另外，竹節(jié)參皂苷IV在9批次藥材中的含量較高，平均含量為42.22 mg/mg，且竹節(jié)參皂苷IV的藥理活性也較好[4,10]，因此在后期《中國藥典》竹節(jié)參含量測定標準修訂時，應考慮納入竹節(jié)參皂苷IV作為質控成分。

本研究還報道了一種快速制備竹節(jié)參總皂苷的方法，即采用乙醇滲濾提取，大孔樹脂一步法快速富集。結果竹節(jié)參總皂苷中竹節(jié)參皂苷V、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷IVa的含量依次為363.14、238.25、51.56 mg/g，13種指標性成分的總含量為773.95mg/g(占比84.36%)，富集效果非常明顯，可以用于后續(xù)的藥效學研究。

綜上所述，本研究報道了一種快速制備竹節(jié)參總皂苷部位的方法，總皂苷部位中總皂苷的含量高達84.1%，富集效果明顯。本實驗基于UPLC-Q/TOF-MS建立了一種同時測定竹節(jié)參藥材和總皂苷部位中13種指標成分含量的方法，該方法簡單快速，精密度、重復性、穩(wěn)定性良好，可用于竹節(jié)參藥材和總皂苷的質量評價，以及為《中國藥典》竹節(jié)參質量標準地提升提供參考依據。