翟孝庭 胡園 黃東宗 史悅怡 李鴻波 胡敏 劉洪臣 姜華

咀嚼是一種節(jié)奏性運(yùn)動(dòng)，需要外周器官、感官輸入和中樞神經(jīng)系統(tǒng)共同協(xié)調(diào)[1]。近年來，咀嚼對學(xué)習(xí)記憶功能的影響受到了廣泛關(guān)注。流行病學(xué)研究表明，缺牙、咀嚼效率低下和義齒功能不良等是造成學(xué)習(xí)記憶能力降低和癡呆癥發(fā)生的危險(xiǎn)因素[2-5]。而良好的咀嚼功能可以改善記憶表現(xiàn)，其機(jī)制可能包括減輕焦慮和壓力[6]、增加腦血流量[1]、外周神經(jīng)刺激傳入激活腦區(qū)[7]等。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，缺牙或咬合紊亂等咀嚼能力降低后，腦內(nèi)海馬區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞密度降低、突觸減少等病理改變[8]；同時(shí)也出現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)和激素水平的改變，如糖皮質(zhì)激素水平上升[9]、乙酰膽堿釋放量減少[10]、腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）水平降低[11]等改變。上述神經(jīng)功能衰退的表現(xiàn)說明咀嚼功能不良可能參與海馬的調(diào)控，與機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力減退有關(guān)[12]。

偏側(cè)咀嚼（chewing-side preference，CSP）是指偏愛使用一側(cè)牙列進(jìn)行咀嚼的不良咀嚼習(xí)慣[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，拔除單側(cè)下頜牙的小鼠在短時(shí)間內(nèi)即出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降的表現(xiàn)，同時(shí)伴有偏側(cè)咀嚼小鼠海馬CA1區(qū)5-羥色胺受體水平降低及CREB-BDNF通路的改變，提示單側(cè)的咀嚼功能障礙可引起神經(jīng)遞質(zhì)的水平改變，參與海馬的調(diào)節(jié)[14，15]。偏側(cè)咀嚼可能也參與認(rèn)知功能減退的進(jìn)程，但其具體機(jī)制尚不清楚[16，17]，需要進(jìn)一步深入研究。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脂質(zhì)濃度僅次于脂肪組織，脂質(zhì)代謝在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，咀嚼活動(dòng)減少后，大鼠的海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)發(fā)生改變[18，19]，而星形膠質(zhì)細(xì)胞主要通過膽固醇的合成與代謝參與突觸功能的調(diào)控及神經(jīng)細(xì)胞的成熟[20]，進(jìn)而影響認(rèn)知功能[21]。神經(jīng)干細(xì)胞的活性也與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)[22]，提示脂質(zhì)代謝紊亂是海馬功能異常的因素之一，可能影響學(xué)習(xí)與記憶功能。

脂質(zhì)組學(xué)（lipid metabolism）是應(yīng)用高通量分析化學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的方法，全面系統(tǒng)地研究生物體受到內(nèi)、外因素刺激后而改變的脂質(zhì)產(chǎn)物，進(jìn)而認(rèn)識生物體的生理和病理狀態(tài)，在探索未知且復(fù)雜的機(jī)制中具有高效性[23]，可用于疾病的機(jī)制研究、早期診斷和探尋靶標(biāo)[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)外周血中某些脂質(zhì)代謝產(chǎn)物與認(rèn)知功能的評分密切相關(guān)，可作為輕度認(rèn)知障礙及阿爾茲海默病的預(yù)測標(biāo)志物[25]。認(rèn)知功能的研究涉及復(fù)雜的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，而脂質(zhì)組學(xué)作為高通量分析方法為揭示發(fā)病機(jī)理提供了極好的手段。

因此，本實(shí)驗(yàn)將通過收集偏側(cè)咀嚼患者血液樣本，利用組學(xué)技術(shù)研究偏側(cè)咀嚼受試者的脂質(zhì)代謝特征，篩選出具有顯著性差異的代謝物及其相關(guān)通路，旨在為咀嚼功能與認(rèn)知功能的相關(guān)研究提供參考。

1.材料和方法

1.1 研究對象及分組 納入2020年9月至2021年3月在解放軍總醫(yī)院口腔科就診的患者為受試者，分為左側(cè)偏側(cè)咀嚼組（left chewing side preference，LCSP）6例、右側(cè)偏側(cè)咀嚼組（right chewing side preference，R-CSP）6例和無偏側(cè)咀嚼對照組（heathy control，HC）6例。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（S2020-327-01），所有受試者自愿參與實(shí)驗(yàn)。

（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過病史調(diào)查和視覺觀察法確認(rèn)偏側(cè)咀嚼及其側(cè)別[26]；②就診前無針對偏側(cè)咀嚼的治療史；③患者牙列相對完整，無根尖周炎、牙周炎和牙列缺損等長期影響咀嚼功能的疾病。

（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重影響咀嚼功能的相關(guān)疾病，如頜面部感染、外傷、類風(fēng)濕性疾病、中重度牙周病及單側(cè)牙列多牙缺失（除第三磨牙外，失牙數(shù)多于1）等。②精神及神經(jīng)病史、腦器質(zhì)性病變等腦部疾病，以及糖尿病、高脂血癥、心血管疾病等全身性疾病。③妊娠期婦女或近期服用代謝調(diào)理相關(guān)藥物的患者。

（3）偏側(cè)咀嚼的判斷：①主訴偏側(cè)咀嚼史長達(dá)3年及以上；②偏側(cè)咀嚼者牙周衛(wèi)生情況存在雙側(cè)不對稱，且咀嚼偏好側(cè)的磨牙面可能有輕到重度磨耗而對側(cè)牙磨耗較輕或無磨耗（圖1）；③讓受試者咀嚼口香糖2 min，每隔15 s打斷，連續(xù)記錄7次，觀察第1、3、5、7次口香糖所在的側(cè)別，如果觀察口香糖3次以上位于同一側(cè)則記錄為偏側(cè)咀嚼[26]。

1.2 研究方法 采集患者血樣后2 h內(nèi)離心（2000 rpm，10 min，4℃），提取血漿并儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱，每位患者取3次平行樣品，進(jìn)行分析。根據(jù)脂質(zhì)提取步驟，取10 μL血漿加入480 μL提取液（MTBE：MeOH=5：1），勻漿后離心（3000 rpm，15 min，4℃），取250 μL上清液。重新加入250 μL提取液，勻漿后離心（3000 rpm，15 min，4℃），取250 μL上清液，重復(fù)步驟1次。最后合并以上3次的上清液，在37℃下真空干燥。向干燥后的代謝物中加入100 μL的溶液（DCM：MeOH：H2O=60：30：4.5）進(jìn)行復(fù)溶，混勻后離心（12000 rpm，15 min，4℃），取30 μL上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測。最后取每個(gè)樣本的10 μL上清液混合成質(zhì)控樣本（Quality Control，QC）進(jìn)行校驗(yàn)。

使用SCIEX ExionLC超高效液相色譜儀，通過ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm，Waters）對目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。流速0.3 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃。流動(dòng)相A為40%水和60%乙腈溶液，流動(dòng)相B為10%乙腈和90%異丙醇溶液。以多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理 將獲得的原始數(shù)據(jù)通過skyline 20.1軟件進(jìn)行處理，通過模式識別對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰解卷積，積分，峰對齊，具有相應(yīng)峰強(qiáng)度的質(zhì)荷比（m/z）和保留時(shí)間的列表。與質(zhì)控樣本QC的原始總離子流（Total Ion Current，TIC）色譜圖疊加對比，觀察儀器的穩(wěn)定性及重現(xiàn)性。

在樣品識別分析之前對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，以消除由樣品之間的體積質(zhì)量或稀釋等造成的差異。將標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。首先采用無監(jiān)督主成分分析方法（Principal Component Analysis，PCA），獲得主成分?jǐn)?shù)目和總體的差異。隨后采用正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Projections to Latent Structures-Discriminant Analysis，OPLS-DA），獲得兩組間顯著差異的相關(guān)代謝物信息。為避免過度擬合，采用7次交叉驗(yàn)證法對模型的質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，并用分析得到的R2X、R2Y和Q（2前兩者代表可解釋性，后者代表模型的可預(yù)測度）對結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。對OPLS-DA中主成分的變量投影重要度（Variable Importance in the Projection，VIP）進(jìn)行排序，VIP＞1表明變量間存在組間差異。采用SPSS20.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05的變量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)用實(shí)驗(yàn)物質(zhì)定量的比值（Fold change，F(xiàn)C）篩選出顯著差別的脂質(zhì)代謝物，F(xiàn)C＞1.5或FC＜0.7則認(rèn)為代謝物具有較大的改變。

通過以上分析得到差異性代謝物，并對其定量值用歐式距離矩陣（Euclidean distance matrix）分析，通過ggcorrplot和dplyr工具包以完全連鎖方法對差異代謝物進(jìn)行聚類，通過pheatmap、dplyr和openxlsx工具包繪制熱圖進(jìn)行展示。分析各代謝物之間的聯(lián)系相關(guān)性，最后通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路的富集分析。

2.結(jié)果

2.1 受試者一般資料及血脂情況 三組受試者的年齡、性別及血脂情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）。

表1 受試者基本信息及血脂情況

2.2 數(shù)據(jù)分析結(jié)果 將三個(gè)QC的正離子檢測模式和負(fù)離子檢測模式的TIC色譜圖分別進(jìn)行疊加比對（圖2）。色譜峰值保留時(shí)間和峰面積基本重合，表明實(shí)驗(yàn)過程中儀器穩(wěn)定性好。

將LC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，提取各代謝物的離子峰，取得的峰數(shù)量為652。經(jīng)過交叉驗(yàn)證后建立PCA和OPLS-DA模型以觀察偏側(cè)咀嚼組和對照組代謝產(chǎn)物的分布情況。所有模型的R2值大于0.4，模型的擬合度良好，檢測結(jié)果未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象（表2）。而L-CSP與R-CSP組對比時(shí)，Q2為負(fù)數(shù)，代表兩樣本差異不明顯。OPLS-DA評分圖顯示L-CSP與HC之間有明顯的區(qū)別（R2X=0.571，R2Y=0.830，Q2=0.384），同時(shí)R-CSP與HC也存在明顯區(qū)別（R2X=0.443，R2Y=0.838，Q2=0.417），提示偏側(cè)咀嚼可引起脂質(zhì)代謝輪廓變化（圖3）。

表2 OPLS-DA模型的參數(shù)

2.2顯著性差異代謝物的篩選 建立OPLS-DA模型后，以VIP＞1，P＜0.05以及FC值作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出顯著差異代謝物（表3、4）。多變量統(tǒng)計(jì)分析共鑒定出L-CSP組與對照組有41個(gè)差異血漿脂質(zhì)代謝物，R-CSP組與對照組有28個(gè)差異血漿脂質(zhì)代謝物，而左右偏側(cè)咀嚼組內(nèi)比較有7個(gè)差異血漿脂質(zhì)代謝物。通過篩選得到了9種顯著性差異代謝物，其中包括磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholines，PC），磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamines，PE），溶血磷脂酰乙醇胺（Lysophosphatidylethanolamines，LPE），神經(jīng)酰胺（Ceramides，CER），鞘磷脂（Sphingomyelines，SM），甘油二酯（Diacylglycerols，DAG），甘油三酯（Triacylglycerols，TAG），游離脂肪酸（Free Fatty Acids，F(xiàn)FA），膽固醇酯（cholinesterase，CE）。

表3 L-CSP組與HC組血脂差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.3 生物信息學(xué)分析 將篩選出的顯著性差異代謝物分別進(jìn)行層次聚類分析（圖4）。L-CSP與HC對比發(fā)現(xiàn)，PC、PE、CER、SM、TAG、CE升高。在DAG的各類同分異構(gòu)分子中，DAG(18：1/22：5)較HC組高，而DAG(16：0/20：5)較HC組低。R-CSP與HC對比發(fā)現(xiàn)，PC、LPA、CER、SM、TAG、FFA升高。在DAG和PE的各類同分異構(gòu)分子中，DAG(18：1/22：5)無明顯差異，PE(16：0/18：1)、PE(16：0/20：3)、PE(18：0/20：4)、PE(18：0/22：5)較對照組高，而DAG(16：0/20：5)以及PE(P-16：0/20：3)較HC組低。

表4 R-CSP組與HC組血脂差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.4 代謝相關(guān)通路分析 將CSP組和HC組的差異性代謝物數(shù)據(jù)通過MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行KEGG的相關(guān)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)改變的通路主要涉及膽固醇代謝，甘油磷脂的代謝，脂肪酸代謝以及類固醇合成等通路（表5）。

表5 部分代謝通路富集分析

3.討論

本研究首次利用脂質(zhì)代謝組學(xué)對偏側(cè)咀嚼者的血漿進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)左側(cè)與右側(cè)偏側(cè)咀嚼者的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物對比沒有明顯差異，表明咀嚼偏好的側(cè)別對脂質(zhì)代謝的影響較小。偏側(cè)咀嚼者與對照組的血漿對比，差異代謝物共有9種，提示偏側(cè)咀嚼可能與脂質(zhì)代謝存在一定的關(guān)聯(lián)。

目前咀嚼功能與腦認(rèn)知功能的關(guān)系受到了廣泛的關(guān)注，但是大部分臨床研究集中于問卷調(diào)查、咬合檢測以及影像學(xué)檢測等觀察性研究，較少涉及疾病機(jī)理的研究[27，28]，而脂質(zhì)組學(xué)作為一種高通量的分析檢測方法，為微創(chuàng)條件下研究疾病的機(jī)制機(jī)理提供了新手段[29]。Mapstone等[30]招募了525名參與者，利用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)血漿中PC(36：6)、PC(38：0)、PC(40：6)、LPC(18：2)等脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的水平與腦認(rèn)知功能表現(xiàn)相關(guān)，可作為認(rèn)知功能降低的相關(guān)預(yù)測指標(biāo)，并且進(jìn)一步聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)退行性疾病與脂質(zhì)代謝和免疫功能密切相關(guān)[31]。此外也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)PC、CE、TAG等十種代謝產(chǎn)物可作為輕度認(rèn)知障礙（MCI）向阿爾茨海默?。ˋD）轉(zhuǎn)變的預(yù)測性指標(biāo)，在認(rèn)知障礙或者AD發(fā)生前，這些生物標(biāo)志物就已經(jīng)出現(xiàn)改變，可以根據(jù)這些生物標(biāo)志物來評估認(rèn)知功能減退的進(jìn)展[25，32]。本研究發(fā)現(xiàn)CSP受試者可能發(fā)生膽固醇代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝以及類固醇合成等通路改變（圖5），與認(rèn)知能力的預(yù)測指標(biāo)存在部分重疊，提示CSP可能與認(rèn)知功能有關(guān)的代謝途徑改變有關(guān)。

磷脂（Phospholipids）、膽固醇（Cholesterol）和脂肪酸（Fatty Acids）具有多種生理功能，包括組裝細(xì)胞膜、儲(chǔ)存能量以及作為信號分子等[33，34]。越來越多的研究表明脂質(zhì)代謝異常是認(rèn)知功能減退的特征，了解代謝產(chǎn)物的改變有助于探尋其作用機(jī)制。

磷脂可分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類，分別由甘油和鞘氨醇構(gòu)成。甘油磷脂是機(jī)體含量最多的一類磷脂，參與細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)[35]。有研究表明甘油磷脂家族中的磷脂酰膽堿水平與處理認(rèn)知的大腦區(qū)域的靜息態(tài)血流量相關(guān)，可作為AD發(fā)生的生物標(biāo)志分子，準(zhǔn)確率達(dá)到83%[31]。Sophie等[36]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)包括磷脂酰膽堿和膽固醇在內(nèi)的11類脂質(zhì)與生成Aβ蛋白的關(guān)鍵酶γ分泌酶活性呈正相關(guān)。Aβ蛋白在AD的發(fā)病機(jī)制中起到了關(guān)鍵作用[25]，Aβ蛋白可激活PLA2家族酶進(jìn)而分解磷脂酰膽堿，釋放次級信號分子如花生四烯酸，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[37]，是認(rèn)知障礙發(fā)生的早期事件[38]。本研究中偏側(cè)咀嚼者的PC水平升高，考慮可能與CSP者腦內(nèi)磷脂代謝有關(guān)。

鞘磷脂（sphingolipid，SM）由PC代謝分解后產(chǎn)生[33]，維持神經(jīng)元功能的基本結(jié)構(gòu)和功能[39]。SM在神經(jīng)細(xì)胞信號傳遞中起著關(guān)鍵作用，包括tau蛋白磷酸化、Aβ代謝、鈣穩(wěn)態(tài)、乙酰膽堿生物合成和細(xì)胞凋亡等[34]。而神經(jīng)酰胺（Ceramide，CER）參與細(xì)胞凋亡、脂筏形成和線粒體呼吸鏈的調(diào)控。CER的累積可引發(fā)一系列導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的事件，包括PI3K/AKT和ERK通路的早期失活以及過氧化物ROS的產(chǎn)生[40]。同時(shí)，脂筏的重塑，尤其是相關(guān)酶活性的增強(qiáng)，可導(dǎo)致神經(jīng)酰胺/鞘磷脂（CER/SM）比值的增加，促進(jìn)了Aβ的產(chǎn)生[41]。本研究中SM、CER的水平升高，且CER/SM的比值增加，提示CSP人群可能發(fā)生細(xì)胞脂閥的穩(wěn)定以及細(xì)胞凋亡信號的傳遞等改變。

膽固醇（Cholesterol）參與了神經(jīng)元分化和重塑、突觸的發(fā)生、神經(jīng)遞質(zhì)的分泌等過程[31]。因血腦屏障的存在，腦內(nèi)的膽固醇主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞合成，星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及功能改變將對膽固醇代謝產(chǎn)生較大的影響[20]。研究表明，咀嚼功能與星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及功能改變密切相關(guān)[18]，可能影響應(yīng)激狀態(tài)[42]。本研究中CSP組的膽固醇酯較對照組高，提示偏側(cè)咀嚼可能參與腦內(nèi)應(yīng)激狀態(tài)的激活，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而對膽固醇代謝產(chǎn)生影響。

脂肪酸代謝在認(rèn)知能力衰退方面的研究廣泛，主要包括飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）、多不飽和脂肪酸（PUFA）在腦內(nèi)的作用。脂肪酸是磷脂與鞘磷脂合成中的關(guān)鍵分子，為脂質(zhì)代謝提供脂肪?；部梢詤f(xié)助載脂蛋白參與膽固醇的運(yùn)輸以及Aβ蛋白的清除[34，38]。此外脂肪酸代謝產(chǎn)物可能參與腦內(nèi)的過氧化，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的生理功能下降和細(xì)胞死亡[39]。本研究中，與對照組對比，CSP組的脂肪酸代謝產(chǎn)物含量呈上升趨勢，提示偏側(cè)咀嚼可能影響了復(fù)雜脂質(zhì)的合成。

本研究運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)初步探究偏側(cè)咀嚼與脂代謝之間的關(guān)系，為偏側(cè)咀嚼與腦功能的研究提供新思路。為了深入探究其潛在的作用機(jī)制，可以考慮擴(kuò)大樣本量對其中的部分通路進(jìn)行靶向代謝組學(xué)研究，同時(shí)可以探討偏側(cè)咀嚼在糾正后是否有類似通路的改變。由于倫理問題本研究選取血漿樣本進(jìn)行研究，但血腦屏障的存在可能對研究的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定的影響，為此需要進(jìn)行動(dòng)物的腦內(nèi)研究，對磷脂代謝、膽固醇代謝以及脂肪酸的代謝具體作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的驗(yàn)證，以探討偏側(cè)咀嚼與脂代謝之間的關(guān)系。

4.小結(jié)

本研究利用偏側(cè)咀嚼者的血漿進(jìn)行脂質(zhì)代謝組學(xué)研究，通過分析發(fā)現(xiàn)偏側(cè)咀嚼可能發(fā)生脂質(zhì)代謝通路的改變，而咀嚼偏好側(cè)的側(cè)別對脂質(zhì)代謝的影響較小。偏側(cè)咀嚼者與對照組比較，共有9種差異性代謝產(chǎn)物水平發(fā)生改變，通過分析發(fā)現(xiàn)通路富集于磷脂代謝、膽固醇代謝以及脂肪酸代謝等代謝通路。提示偏側(cè)咀嚼可能與脂質(zhì)代謝存在一定的關(guān)聯(lián)，具體的影響機(jī)制有待進(jìn)行靶向代謝組學(xué)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。