王貞麗，王志鵬，崔莉莉，宋新華，許封菁，高守紅

新型冠狀病毒肺炎是一種急性呼吸道傳染病。具有傳播速度快，傳播能力強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間久，且可通過輕癥甚至無癥狀者傳播。中醫(yī)藥作為世界傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在新型冠狀病毒肺炎疫情期間，其早期介入、分類救治和后期康復(fù)的方法，都有舉足輕重的作用［1］。對(duì)于恢復(fù)期患者以扶正為主、兼以驅(qū)邪的治療原則，恢復(fù)人體“正氣”，提高機(jī)體抗病能力。火神山醫(yī)院新冠肺炎恢復(fù)期肺脾氣虛湯由法半夏、陳皮、黨參、炙黃芪、茯苓、藿香、砂仁等7 味藥材組成，用于治療以氣短，倦怠乏力，納差嘔惡，痞滿，大便無力，便溏不爽，舌淡胖，苔白膩為主要表現(xiàn)的恢復(fù)期證候［2］。研究表明法半夏多糖可作為治療哮喘炎癥和粘液過度分泌的藥物［3］；炙黃芪具有非特異性免疫和巨噬細(xì)胞吞噬能力，且有較好的補(bǔ)氣作用［4］；陳皮廣泛應(yīng)用于臨床治療惡心、嘔吐、消化不良、乏力、腹瀉、咳嗽、咳痰等［5］；黨參可以改善不良的胃腸功能，治療胃潰瘍和慢性胃炎［6］。

本研究應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS），對(duì)肺脾氣虛湯中15 種主成分（原兒茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、異槲皮苷、去氫土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白術(shù)內(nèi)脂Ⅲ、毛蕊異黃酮、桔皮素、川陳皮素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷）進(jìn)行含量測定，為其質(zhì)量控制及臨床用藥安全提供保障［7-8］。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1200 系列高效液相色譜儀（Agilent Technologies，美 國），包 括G1311A 型 四 元 泵、G1322A 型真空脫氣機(jī)、G1329A 型自動(dòng)進(jìn)樣器和G1316A 型柱溫箱。安捷倫6410A 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀由美國安捷倫科技公司制造（Agilent Technologies，美國），離子源為ESI 型，數(shù)據(jù)采集及處理系統(tǒng)采用MassHunter 化學(xué)工作站。定時(shí)可調(diào)速旋渦混合器（美國labnet 公司），Eppendorf 5418R 型臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），百萬分之一電子天平，MES3.6P-0CE0DM 型（賽多利斯，哥廷根，德國，最大稱重3.1 g，分辨率0.001 mg）；單通道移液槍，Reaserch plus 型，量程10、20、100、200、1 000 μl（德國Eppendorf 公司）。超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，SK7200H 型）。渦旋混勻器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，Vortex QL-901 型），煎藥壺（蘇泊爾液體加熱器，SW-30Y06），灌裝針頭式濾器（上海泰坦科技股份有限公司，聚醚砜PES，0.22 μm，13 mm）。

1.2 試劑及藥品

對(duì)照品：原兒茶醛（批號(hào)：MB7049）、芒柄花素（批號(hào)：MB1977）、芹菜素（批號(hào)：MB6830）、異槲皮苷（批號(hào)：MB7071）購自美倫生物有限公司，甘草苷（批號(hào)：Z13J11X108109）、去氫土莫酸（批號(hào)：Z25J10S939 09）、茯苓新酸A（批號(hào)：P07J8L28173）、刺槐素（批號(hào)：C12O8Q45551）、橙皮苷（批號(hào)：P06D9F77001）、毛蕊異黃酮苷（批號(hào)：Y13F11H108672）、毛蕊異黃酮（批號(hào)：Y24N9Y75652）、刺芒柄花苷（批號(hào)：P03A10F84910）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)：M13D10S10567 6）、桔皮素（批號(hào)：H24F11K108893），川陳皮素（批號(hào)：N10J10R90249）、內(nèi)標(biāo)利血平（批號(hào)：Y02M11Y17235）購自上海源葉有限公司；中藥飲片：法半夏、陳皮、黨參、炙黃芪、茯苓、藿香、砂仁由購自上海長征醫(yī)院藥劑科，經(jīng)鑒定為正品；試劑：甲醇（質(zhì)譜純，Merck 公司，德國），乙腈（質(zhì)譜純，Merck 公司，德國），甲酸（色譜純，天地公司，美國），蒸餾水（屈臣氏，中國）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB - C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸-5 mmol/L醋酸銨水溶液，梯度洗脫，流速0.4 ml/min，進(jìn)樣量5 μl，柱溫35 ℃，正離子運(yùn)行時(shí)間7.5 min，負(fù)離子運(yùn)行時(shí)間8.5 min，梯度洗脫條件見表1。

表1 正負(fù)離子化合物不同梯度洗脫條件

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧（ESI）離子源，監(jiān)測模式選擇正負(fù)離子模式分析，質(zhì)譜噴霧針電壓（Capillary）設(shè)置為4 000 V，離子源溫度設(shè)置為350 ℃。霧化氣及干燥氣選用氮?dú)猓∟2），碰撞池所用氣體為高純N2，設(shè)置壓力為0.1 MPa（1.0 ATA）；其他質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果如下：霧化氣壓力設(shè)置為0.276 MPa；MS1 和MS2 的加熱溫度均為105 ℃；氣體流速設(shè)置為10 ml/min，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）。所測定的對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，ESI 電離方式下，進(jìn)行產(chǎn)物離子全掃描分析，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 肺脾氣虛湯中15 種主成分質(zhì)譜條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱定原兒茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、異槲皮苷、去氫土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白術(shù)內(nèi)脂Ⅲ、毛蕊異黃酮、桔皮素、川陳皮素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷、華法林和利血平對(duì)照品約2.00 mg，分別置于2 ml 容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，分別得到濃度約為1.00 mg/ml 的對(duì)照品貯備液。再分別精密量取對(duì)照品貯備液適量，以甲醇依次稀釋成濃度為100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/ml 的對(duì)照品溶液。于-20 ℃冰箱保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取肺脾氣虛湯方藥1 份，加水800 ml，浸泡30 min 后，煎煮100 min，冷卻，過濾，量取煎煮液10 ml，水浴蒸干，加70% 乙醇溶液1 ml 溶解后，14 000 r/min，離心20 min，取上清液，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液以及空白溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明，供試品色譜中與對(duì)照品色譜上相同保留時(shí)間有對(duì)應(yīng)的色譜峰，峰形良好?？瞻兹芤荷V中，在相同的保留時(shí)間無色譜峰，說明本方法專屬性好，結(jié)果見圖1。

圖1 肺脾氣虛湯中15 種主成分及內(nèi)標(biāo)的色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1 中對(duì)照品溶液適量，甲醇稀釋成對(duì)照品濃度為白術(shù)內(nèi)脂Ⅲ和桔皮素為50、100、125、250、500、1 000、1 250 ng/ml，毛蕊異黃酮和芒柄花苷為100、200、250、500、1 000、2 000、2 500 ng/ml，川陳皮素和毛蕊異黃酮苷為200、400、500、1 000、2 000、4 000、5 000 ng/ml，原兒茶醛、芹菜素和異槲皮苷為50、80、100、200、400、800、1 000 ng/ml，甘草苷為5、8、10、20、40、80、100 ng/ml，橙皮苷為10 000、16 000、20 000、40 000、80 000、160 000、200 000 ng/ml，芒柄花素為150、240、300、600、1 200、2 400、3 000 ng/ml，刺槐素為500、800、1 000、2 000、4 000、8 000、10 000 ng/ml，去氫土莫酸為15、24、30、60、120、240、300 ng/ml，茯苓新酸A 為1、1.6、2、4、8、16、20 ng/ml，內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/ml 的7-1 號(hào)系列梯度，按照“2.1”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定；上述測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分析物濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各組分的線性回歸方程和范圍，結(jié)果顯示15 種成分的r值均大于在0.99，線性關(guān)系良好，結(jié)果見表3。

表3 肺脾氣虛湯各成分的線性考察結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，并計(jì)算15 種主成分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD 結(jié)果在1.0%～7.7%之間，均小于15%，表明該方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表4。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，并計(jì)算15 種成分峰面積的RSD值，RSD 結(jié)果在0.8%～5.9%之間，均小于15%，表明儀器精密度良好，結(jié)果見表4。

表4 肺脾氣虛湯15 種主成分的重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性RSD 考察（%）

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測定峰面積，并計(jì)算15 種成分峰面積的RSD值，去氫土莫酸和茯苓新酸A 在4 h 內(nèi)的RSD 小于15%，其它13 種化合物24 h 內(nèi)的RSD 均小于15%，表明供試品溶液中去氫土莫酸和茯苓新酸A兩種成分在4 h 內(nèi)穩(wěn)定，其它13 中成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測定的肺脾氣虛湯樣品6 份，精密加入與樣品中各成分含量相當(dāng)?shù)幕旌蠈?duì)照品溶液至50 ml 容量瓶中，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，記錄待測成分的峰面積，并計(jì)算回收率及RSD 值。平均加樣回收率為95.53%～108.96%，RSD 在0.4%～9.6% 之間，表明提取方法的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表5。

表5 肺脾氣虛湯各組分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品測定 取5 批肺脾氣虛湯樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表6。

表6 5 批肺脾氣虛湯樣品中15 種化合物的含量(μg/g)

3 討論

采用UHPLC-MS/MS 法對(duì)肺脾氣虛湯中原兒茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、異槲皮苷、去氫土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白術(shù)內(nèi)脂Ⅲ、毛蕊異黃酮、桔皮素、川陳皮素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷等15 種主成分進(jìn)行了方法建立與優(yōu)化，保證了肺脾氣虛湯的質(zhì)量控制。由于該方中各成分之間存在含量高低不均等問題，故為實(shí)現(xiàn)15 種成分完全分離和快速檢測，分別對(duì)色譜柱、流動(dòng)相組合以及流動(dòng)相梯度進(jìn)行優(yōu)化，最終以Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）色譜柱，流動(dòng)相A 為0.1%甲酸乙腈溶液，流動(dòng)相B 為0.1%甲酸-5 mmol/L醋酸銨溶液，梯度洗脫進(jìn)行分析。由于安捷倫6410A 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀不能在同一時(shí)間段正負(fù)離子同時(shí)切換，所以建立了正離子和負(fù)離子兩套梯度洗脫程序，并進(jìn)行了兩套方法學(xué)驗(yàn)證。在此條件下，15 種成分色譜分離效果較好，專屬性強(qiáng)，分析時(shí)間短。

在含量測定的指標(biāo)成分選擇上，法半夏藥材的炮制中，帶入了甘草，故選擇甘草苷進(jìn)行測定；芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷4 種來源于炙黃芪藥材的成分，為方中的補(bǔ)中益氣成分；由含量測定結(jié)果可知，來源于陳皮中的橙皮苷、桔皮素、川陳皮素在該處方中的含量較高，研究證實(shí)這些成分均有一定的保肝、祛痰止咳等藥理作用；其它成分分別具有補(bǔ)氣健脾，祛濕化痰等作用；故本研究將此15 種成分作為最終的含量測定指標(biāo)。

綜上所述，本研究建立的UHPLC-MS/MS 法同時(shí)測定肺脾氣虛湯中原兒茶醛、芒柄花素、芹菜素、刺槐素、甘草苷、異槲皮苷、去氫土莫酸、茯苓新酸A、橙皮苷、白術(shù)內(nèi)脂Ⅲ、毛蕊異黃酮、桔皮素、川陳皮素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮苷等15 種主成分的定量方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，為評(píng)價(jià)肺脾氣虛湯的質(zhì)量，保證其用藥的安全提供參考。