沈勇 翁云龍 肖齊俊 李路 張文兵 邵敏

ICU治療中應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、廣譜抗生素、機(jī)械通氣等，均為發(fā)生侵襲性肺部真菌感染(invasive pulmonary fungal infections， IPFI)的獨(dú)立影響因素[1]，致病真菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性和耐藥性有差異[2]。使用無效抗真菌藥物治療與完全沒有接受治療的患者死亡率相似，且延遲開始抗真菌治療與增加死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[3]。IPFI患者能否實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)抗真菌治療？真菌培養(yǎng)有孵育周期較長(zhǎng)、檢出率低、易受污染等缺點(diǎn)，典型CT影像學(xué)可作為輔助診斷依據(jù)之一，需結(jié)合基礎(chǔ)疾病初步診斷[4]，血清真菌成分抗體、抗原PCR、二代基因測(cè)序等診斷技術(shù)臨床普及尚任重道遠(yuǎn)[5]，有研究表明肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)對(duì)IPFI、侵襲性曲霉病早期診斷優(yōu)于血清，且最佳診斷閾值分別為157 ng/L、1.08 μg/L[6]。故我們探討IPFI真菌分布及各種真菌肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)診斷價(jià)值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018LL-ky020)。選取2018年5月～2020年9月期間， 本院ICU和EICU收治的入院時(shí)有侵襲性肺部真菌感染(IPFI)高危因素患者96例，按照《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南(2007)》執(zhí)行[7]，具體簡(jiǎn)要如下：①有至少1項(xiàng)宿主因素，②有肺部感染癥狀，③且具有無菌術(shù)下取得的肺組織、胸腔積液、血液、下呼吸道標(biāo)本組織病理學(xué)檢出隱球菌、真菌菌絲、肺孢子菌包囊、滋養(yǎng)體、囊內(nèi)小體或排除標(biāo)本污染情況下培養(yǎng)出真菌生長(zhǎng)二者之一。患者病情不能耐受纖支鏡檢查或可能短期內(nèi)死亡、患者或家屬不同意纖支鏡或反復(fù)檢測(cè)者排除，使用人血白蛋白等血制品、哌拉西林他唑巴坦及磺胺類抗生素、抗腫瘤藥物等可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的患者需停藥48 h，否則剔除。最終符合納入標(biāo)準(zhǔn)并簽署知情同意書患者中確診IPFI 72例，其中男性42例，女性30例，年齡(59.6±11.6)歲，住院日數(shù)(17.9±4.9)日，基礎(chǔ)疾病情況及構(gòu)成比(見表1)。

表1 IPFI患者基礎(chǔ)疾病分布及構(gòu)成比

二、方法

1 標(biāo)本采集 依據(jù)患者肺部CT影像學(xué)定位感染性病變所在地為目標(biāo)肺段，在1、3、5日進(jìn)行肺泡灌洗，留取肺泡灌洗液進(jìn)行G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)、真菌培養(yǎng)、離心沉淀后顯微鏡下革蘭染色和墨汁染色顯影法鏡檢，同時(shí)抽取靜脈血標(biāo)本進(jìn)行血清G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)、血常規(guī)、CRP等檢測(cè)。

2 菌株鑒定及分組依據(jù)直接鏡檢墨汁染色見圓形厚壁孢子、內(nèi)有大小不等反光顆粒，尤其是外有肥厚的折光性莢膜，鑒定為隱球菌屬。標(biāo)本在沙保培養(yǎng)基，37℃溫箱孵育48～72 h，最遲120 h未見真菌菌落生長(zhǎng)為陰性。分離鑒定按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，假絲酵母菌進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、同化實(shí)驗(yàn)對(duì)真菌菌落形態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步鑒別。

三、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、真菌分布顯微鏡直接鏡檢出隱球菌5例，肺泡灌洗液真菌培養(yǎng)分離出5種89株真菌，分離率17.87%(95%CI：7.42%～40.23%)，其中白色假絲酵母菌分離率21.30%(95%CI：8.38%～42.15%)、光滑假絲酵母菌分離率16.95%(95%CI：6.53%～37.89%)、熱帶假絲酵母菌分離率12.35%(95%CI：5.45%～31.64%)、克柔假絲酵母菌分離率11.63%(95%CI：4.75%～29.97%)、曲霉菌7.24%(95%CI：3.88%～25.61%)。鑒定前五種主要致病菌屬白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、曲霉菌、光滑假絲酵母菌、隱球菌分別占40.5%、22.47%、12.36%、11.23%、5.62%。詳(見表2)。

表2 IPFI患者感染真菌分布及構(gòu)成比

二、常見幾種真菌肺部感染患者肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)各真菌種屬組中，不同菌種屬組間的血清、肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)水平，以及血清、肺泡灌洗液GM實(shí)驗(yàn)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。進(jìn)一步的SNK-q兩兩比較發(fā)現(xiàn)，隱球菌和毛霉菌的血清、肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)水平低于其他菌種(P均<0.05)，曲霉菌屬的血清、肺泡灌洗液GM實(shí)驗(yàn)水平高于其他菌種(P均<0.05) 。詳見(表3、4)。

表3 不同真菌種屬血清、肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)水平均值比較

表4 不同真菌種屬血清、肺泡灌洗液GM實(shí)驗(yàn)水平均值比較

三、納入本研究4例淹溺患者中2例痰涂片見酵母樣真菌伴出芽，肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)升高，GM實(shí)驗(yàn)升高不明顯，培養(yǎng)為白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌各1例，另2例見痰中帶暗紅色出血，肺部CT見多發(fā)圓球形稍高密度病灶(詳見附圖1)，同時(shí)存在不對(duì)稱肢體乏力，顱腦MR見多發(fā)圓球形病灶(詳見附圖2)，痰涂片見菌絲，肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)均升高，尤其GM實(shí)驗(yàn)升高明顯，培養(yǎng)為煙曲霉、黑曲霉各1例。

圖1 肺部曲菌感染CT影像

圖2 腦部曲菌感染MR影像

討 論

白色假絲酵母菌是單細(xì)胞真菌，是上呼吸道最常見的定植真菌之一，為條件致病真菌，在一項(xiàng)發(fā)展中國(guó)家研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)械通氣的第7天，有10%的患者出現(xiàn)血液念珠菌血癥，真菌培養(yǎng)陽(yáng)性的下呼吸道標(biāo)本表明，有17%的患者發(fā)現(xiàn)了肺部的真菌入侵[13]。長(zhǎng)時(shí)間使用廣譜抗菌素引起菌群失調(diào)感染和機(jī)械通氣等原因?qū)е孪潞粑勒衬て琳掀茐?，同時(shí)使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑，使酵母相得以向菌絲相轉(zhuǎn)變，酵母菌出芽似菌絲伸展附著侵入組織，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，吞噬細(xì)胞介入細(xì)胞體液免疫，釋放真菌細(xì)胞壁主要組分葡聚糖，故早期肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)是重要的診斷手段，甚至早于血清G實(shí)驗(yàn)[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌同種屬不同類真菌感染患者肺泡灌洗液和血清G實(shí)驗(yàn)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，若非進(jìn)行臨床研究和耐藥分析，進(jìn)一步鑒定菌株的臨床意義不大。

本研究發(fā)現(xiàn)IPA患者肺泡灌洗液、血清GM實(shí)驗(yàn)有診斷價(jià)值。曲霉菌屬是絲狀真菌，半乳甘露糖是其細(xì)胞壁組成成分一種，在免疫功能不全患者，如肺移植后患者的呼吸道中定植曲霉菌在下呼吸道生長(zhǎng)較快，菌絲穿透血管，引起血管炎及血管周圍炎，可血栓形成，炎癥細(xì)胞參與吞噬、消化并釋放半乳甘露糖。Shahid Husain等[15]研究表明使用支氣管肺泡灌洗培養(yǎng)法和半乳甘露聚糖檢測(cè)方法的使用顯著降低了肺移植患者侵襲性曲霉病的延遲治療風(fēng)險(xiǎn)，與常規(guī)預(yù)防方法相比，抗真菌暴露量降低了50%。

國(guó)內(nèi)外對(duì)淹溺并發(fā)侵入性肺真菌感染研究和報(bào)道較少，本研究有4例淹溺患者納入研究，均系嚴(yán)重淹溺，入院時(shí)并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),同時(shí)存在機(jī)械通氣、早期使用糖皮質(zhì)激素情況，且早期抗感染未覆蓋真菌，臨床表現(xiàn)為持續(xù)中度發(fā)熱，其中2例痰涂片見酵母樣真菌伴出芽，肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)升高，GM實(shí)驗(yàn)升高不明顯，培養(yǎng)為白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌各1例，可能與有創(chuàng)機(jī)械通氣和激素使用，造成上呼吸道定植酵母菌條件下侵入下呼吸道感染；另2例臨床見痰中帶暗紅色出血，肺部CT、顱腦MR見多發(fā)感染膿腫病灶，痰涂片見菌絲，肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)均升高，尤其GM實(shí)驗(yàn)升高明顯，培養(yǎng)為煙曲霉、黑曲霉各1例，符合IPA易侵襲血管引起出血及經(jīng)血液遠(yuǎn)處播散感染的表現(xiàn)，且此2例患者發(fā)病時(shí)淹溺均吸入非流動(dòng)污水，符合吸入致病性曲霉菌混合感染的致病機(jī)制，肺部影像學(xué)與肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，有利于IPA的早期診斷。

國(guó)外新型隱球菌動(dòng)物模型研究，從吸入隱球菌真菌顆粒，氣道常駐細(xì)胞識(shí)別、招募對(duì)新型隱球菌的先天免疫、晚期適應(yīng)性細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)新型隱球菌的免疫，再到潛伏真菌感染的再激活模型：肉芽腫遏制的分解，提示多發(fā)生免疫功能低下人群[16]。本研究發(fā)現(xiàn)隱球菌感染患者無論是真菌培養(yǎng)、血清、肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)檢出率均不高，可能是因?yàn)殡[球菌是條件致病真菌，在免疫低下患者中感染機(jī)率加大，且多為亞急性或慢性深部局限性感染，菌體有厚的莢膜，在非進(jìn)展成播散感染的嚴(yán)重階段，肺泡灌洗液和血清G實(shí)驗(yàn)水平一般較低，與國(guó)外隱球菌致病機(jī)制研究基本符合。吳歡歡等在25位艾滋病并發(fā)肺部隱球菌感染接受測(cè)試的患者中，有23位(92.00%)在血清隱球菌莢膜多糖抗原測(cè)試中呈陽(yáng)性[17]，在缺乏對(duì)真菌抗原進(jìn)行檢測(cè)的基層醫(yī)院，對(duì)呼吸道標(biāo)本的反復(fù)墨汁染色鏡檢可能有直接和有利診斷。毛霉菌性肺炎臨床表現(xiàn)無特異性 ,早期呼吸道組織標(biāo)本病理學(xué)證據(jù)對(duì)于診斷尤為重要[18]。肺部毛霉菌感染患者血清、肺泡灌洗液G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)水平低下，可能因?yàn)槔龜?shù)少代表性差，且毛霉菌為結(jié)合菌屬，真菌細(xì)胞壁不含葡聚糖和半乳甘露糖，故這種成分檢測(cè)實(shí)驗(yàn)無診斷價(jià)值。

在侵襲性肺部真菌感染的早期診斷中，對(duì)真菌細(xì)胞壁成分實(shí)驗(yàn)檢測(cè)是一項(xiàng)重要的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，但是考慮到感染不同種屬真菌存在微生物學(xué)差別以及在感染中病理生理學(xué)特點(diǎn)不同，G實(shí)驗(yàn)診斷假絲酵母菌，G實(shí)驗(yàn)聯(lián)合GM實(shí)驗(yàn)診斷曲霉菌屬有臨床價(jià)值，二者對(duì)新隱球菌、毛霉菌診斷價(jià)值不大。