冷 玥，張 濤,趙津璋,劉 洋，王柏欣△

(1.佳木斯大學，黑龍江佳木斯 154000；2.北京市石景山醫(yī)院腫瘤科，北京 100042)

結直腸癌是一種臨床常見惡性腫瘤，我國結直腸癌發(fā)病率和病死率在近年來一直呈上升趨勢，給人民健康和生活質(zhì)量造成嚴重威脅[1]。已有研究報道表明結直腸癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移等過程是由多種因素共同造成的病理過程，多種基因、信號通路及蛋白質(zhì)在其中發(fā)揮重要的作用[2]。小腦鋅指結構(zinc finger protein of the cerebellum，ZIC)家族包括ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5，各自編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，組成5個Cys2His鋅指結構域[3]。越來越多的研究顯示，ZIC5蛋白參與前列腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-6]。Krüppel樣因子5(Krüppel like factor 5，KLF5)是人體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與腫瘤細胞增殖、凋亡和遷移有密切關系[7]。既往有關結直腸癌組織ZIC5和KLF5蛋白表達的研究報道較少且研究結論不一致，本研究采用免疫組織化學法和Western blot檢測結直腸癌組織ZIC5和KLF5表達水平，分析其與患者病理特征相關性并初步探討其對預后的判斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年8月北京市石景山醫(yī)院收治的74例結直腸癌患者的血液標本和結直腸癌組織、癌旁組織(距離腫瘤組織外緣>5 cm)作為研究材料。納入標準：(1)經(jīng)手術切除組織病理學檢查診斷為結直腸癌；(2)術前未接受放療、化療、靶向治療或免疫治療；(3)臨床和隨訪資料完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)既往有結直腸手術史者；(3)臨床資料不完整者；(4)失訪或因結直腸癌以外原因死亡者。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核，所有患者對本研究均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學

本研究中所有的組織石蠟切片均由北京市石景山醫(yī)院病理科切片制備，厚度4 μm。研究采用S-P免疫組織化學法檢測結直腸癌組織和癌旁組織ZIC5和KLF5蛋白的表達情況，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。陰性和陽性對照分別為磷酸鹽緩沖液和已知的ZIC5和KLF5陽性標本。ZIC5主要定位于細胞質(zhì)，同時在細胞核中也有少量表達；KLF5主要表達在細胞質(zhì)和細胞核中，以特定部位出現(xiàn)淡黃色至棕褐色判斷為陽性。以染色強度和視野內(nèi)陽性細胞百分比綜合評判ZIC5和KLF5蛋白表達強度。(1)染色強度：0分，無著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。(2)陽性細胞百分比：0分，未見陽性細胞；1分，陽性細胞百分比<10%；2分，陽性細胞百分比10%～<50%；3分，陽性細胞百分比50%～<75%；4分，陽性細胞百分比≥75%。染色強度和陽性細胞百分比評分乘積作為最后結果，其中0分為陰性，1～3分為低表達，>3分為高表達。本研究所使用的S-P免疫組織化學法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，鼠抗人ZIC5抗體和鼠抗人KLF5抗體購自美國Abcam公司。

1.2.2Western blot

第1步，取石蠟切片脫水后稱取50 mg組織，冰浴研磨后超聲破碎，于4 ℃，18 000 r/min離心30 min，取上清液。第2步，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。第3步，取50 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第4步，TBST緩沖液洗膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗(ZIC5和KLF5一抗稀釋度均為1∶15 000)，4 ℃冰箱孵育過夜。第5步，TBST洗膜30 min，1∶1 000二抗孵育2 h后加入堿性磷酸酶底物，顯色液顯色。第6步，使用UPV掃描儀進行掃描，ZIC5蛋白分子量為66×103，KLF5蛋白分子量為52×103，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.3隨訪

對患者進行隨訪，末次隨訪時間為2021年4月，記錄無病生存期(disease-free survival，DFS)和總生存期(overall survival，OS)。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的計量資料以M(Q1,Q3)表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用Kaplan-Meier法制作生存曲線并進行Log-Rank比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學結果

與癌旁組織比較，結直腸癌組織ZIC5和KLF5的陽性率及高表達率更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

A.ZIC5在結直腸癌組織表達陽性；B.ZIC5在癌旁組織表達陰性；C.KLF5在結直腸癌組織表達陽性；D.KLF5在癌旁組織表達陰性。

表1 ZIC5和KLF5在結直腸癌組織和癌旁組織的表達情況[n=74,n(%)]

2.2 Western blot結果

結直腸癌組織ZIC5和KLF5表達強度高于癌旁組織，見圖2。

圖2 Western blot檢測組織ZIC5和KLF5蛋白的表達水平

2.3 結直腸癌組織ZIC5和KLF5表達與病理特征關系

結直腸癌組織ZIC5的表達情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期、浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移有相關性，KLF5表達情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期和浸潤深度有相關性(P<0.05)，見表2。

表2 結直腸癌組織ZIC5和KLF5蛋白表達與病理特征關系(n)

2.4 結直腸癌組織ZIC5和KLF5表達水平與患者預后關系

ZIC5和KLF5蛋白陰性的結直腸癌患者的DFS、OS長于陽性患者(P<0.05)，見表3，圖3。

圖3 DFS和OS生存曲線比較

表3 ZIC5和KLF5表達與結直腸癌患者DFS、 OS關系分析[M(Q1,Q3)，月]

3 討 論

隨著世界醫(yī)療水平的不斷完善，人類的平均壽命得以延長，但惡性腫瘤的發(fā)病率卻隨之不斷攀升，其中結直腸癌已經(jīng)成為影響人類生命健康的重要疾病之一。我國結直腸癌發(fā)病率和病死率較高，這與我國居民健康和體檢篩查意識較弱及結直腸癌臨床癥狀不特異有關[8-9]，成為限制結直腸癌預后的因素。近年來，隨著腸鏡和分子生物學等技術的進步和深入應用，結直腸癌的檢出率明顯提高，然而大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)為中晚期[10-11]。因此，有必要對結直腸癌的發(fā)病、進展及預后影響因素和機制進行深入研究，探索結直腸癌的診斷、預后評估新指標，治療新靶點，為改善結直腸癌患者整體預后提供新的思路和方向。

當前外周血血清中癌胚抗原、癌抗原(CA)125、CA199等腫瘤標志物對結腸癌患者手術根治后隨訪和評估的價值已得到廣泛認可[12-13]。然而，受限于上述血清標志物的靈敏度及特異度較低[14]，仍然有部分結腸癌復發(fā)病例術后血清學未能檢測出上述標志物的升高,從而延誤術后復查影響遠期生存，急需新的預后標志物早期識別術后復發(fā)高危人群以進行術后分層管理。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)ZIC5在前列腺癌、肺癌和膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài)[15-16]，同時楊麗等[17]研究證實ZIC5在肝癌中的表達水平升高且與疾病進展及肝硬化有相關性，但MA等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)胃癌與ZIC1相關，但與ZIC5無關，這說明ZIC5的表達存在著組織特異性。目前已掌握的研究認為ZIC5可能通過以下幾個機制在腫瘤的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮作用：(1)ZIC5通過血小板源性生長因子D(PDGFD)激活FAK和STAT3，從而促進腫瘤增殖和侵襲[19]；(2)ZIC5能夠調(diào)節(jié)Wnt-β-catentin信號通路進而促進腫瘤增殖、侵襲和遷移[20]；(3)ZIC5蛋白抑制CCNB1基因的表達并促進Ki67基因表達，從而促進腫瘤進展[5]。在本次研究中，經(jīng)過研究人員對比分析結直腸癌組織ZIC5的陽性率和高表達率均明顯高于癌旁組織，ZIC5表達情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期、浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移具有明顯關系，ZIC5蛋白陰性表達的結直腸癌患者預后明顯優(yōu)于陽性表達患者。

KLF5能夠促進細胞的正常生長與分化，目前對于KLF5在腫瘤中的功能已有廣泛研究，通過文獻調(diào)研顯示KLF5在不同腫瘤中的作用不同，如在乳腺癌中KLF5能夠促進腫瘤進展和侵襲[21]，而在食管癌中KLF5則表現(xiàn)為抑癌基因的特點[22]。在本研究中，結直腸癌組織KLF5的陽性表達率和高表達率均明顯高于癌旁組織。KLF5的表達情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期、浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移有明顯關系，KLF5蛋白陰性表達的結直腸癌患者的OS和DFS明顯長于陽性表達患者。王文韜等[23]研究中也發(fā)現(xiàn)結直腸癌腫瘤組織KLF5蛋白呈高表達，且與腫瘤的浸潤深度、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移等病理特征有關，其還認為KLF5蛋白可能通過調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-2、MMP-9而促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結直腸癌組織ZIC5和KLF5的表達增強，與腫瘤的分化程度、TNM分期、浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移等病理學特征相關，ZIC5和KLF5或可作為結直腸癌患者的預后標志物及潛在的治療靶點，但具體機制有待深入研究。