鄒媛遠(yuǎn)，黃 洋，周連幫

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，合肥 230601)

胃腺癌是一種起源于胃黏膜的惡性腫瘤,其最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃腺癌患者的治療反應(yīng)、局部復(fù)發(fā)和長(zhǎng)期生存直接相關(guān)，不僅能夠評(píng)價(jià)患者的預(yù)后，而且對(duì)于治療模式的選擇也是至關(guān)重要的[1]。單細(xì)胞RNA測(cè)序是一種在單細(xì)胞水平上對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序的新技術(shù)。一些基于單細(xì)胞測(cè)序?qū)ξ赴┑难芯恳呀?jīng)發(fā)表，但較少涉及與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)細(xì)胞學(xué)的研究[2-4]。本研究收集淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性及陰性的胃腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本，采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析，利用實(shí)時(shí)定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)對(duì)相關(guān)分子表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，旨在發(fā)現(xiàn)與胃癌淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)的細(xì)胞學(xué)特征及分子改變，為胃癌的臨床診斷和治療提供了新的見(jiàn)解，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年9-12月本院接受胃切除手術(shù)的13例胃腺癌患者術(shù)中切除的腫瘤組織及癌旁組織，標(biāo)本經(jīng)病理檢查確診。患者術(shù)前未進(jìn)行過(guò)放化療,且對(duì)本研究均知情同意。單細(xì)胞RNA文庫(kù)試劑盒均由南京新格元生物有限公司提供；SYBR?Green PCR(PowerTrackTMSYBR Green Master Mix)試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific有限公司。

1.2 方法

1.2.1分組

單細(xì)胞RNA測(cè)序：胃癌組織及癌旁組織根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分為4種類(lèi)型，即N1、T1(無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌旁及腫瘤組織)，N2、T2(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌旁及腫瘤組織)。RT-qPCR：胃癌標(biāo)本13例依據(jù)術(shù)后病理結(jié)果分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組。

1.2.2單細(xì)胞RNA測(cè)序

按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行單細(xì)胞分離。利用Seurat程序進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)型鑒定和聚類(lèi)分析，將FindClusters函數(shù)的參數(shù)分辨率設(shè)置為0.6用于集群分析。使用功能FindMarkers對(duì)不同標(biāo)本或連續(xù)聚類(lèi)之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)XIST和CXCL5表達(dá)水平

提取胃癌組織按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt法計(jì)算。以GAPDH為內(nèi)參，XIST上游引物5′-TGG ATA GAG GAC CCA AGC GA-3′，下游引物5′-CAA GAC TGG CCC AGG CAT AA-3′；CXCL5上游引物5′-CAA GTT CCC TCC CCA CTC AC-3′，下游引物5′-TGC TAA AAA CCC GAC AGG CA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CAA CGA ATT TGG CTA CAG CA-3′，下游引物5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胃腺癌中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜和不同細(xì)胞類(lèi)型

分別從淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽(yáng)性組的胃腺癌組織中獲得1 461和2 951個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，共鑒定出10種主要細(xì)胞類(lèi)型。與淋巴轉(zhuǎn)移陰性組比較，淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的主細(xì)胞占比明顯升高，見(jiàn)圖1。

圖1 胃腺癌中不同細(xì)胞類(lèi)型占比

2.2 與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種主細(xì)胞亞型

根據(jù)主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜自動(dòng)聚類(lèi)，主細(xì)胞亞聚類(lèi)顯示4簇，分別為主細(xì)胞1、主細(xì)胞2、主細(xì)胞3和主細(xì)胞4。采用擬時(shí)序分析法進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄軌跡分析，發(fā)現(xiàn)存在主細(xì)胞2、主細(xì)胞3、主細(xì)胞1向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過(guò)渡狀態(tài)。主細(xì)胞3在淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的胃癌組織標(biāo)本中明顯富集，見(jiàn)圖2。

A：主細(xì)胞亞聚類(lèi)的比例；B：從主細(xì)胞到癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程。

2.3 與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種窩狀黏液細(xì)胞亞型

窩狀黏液細(xì)胞亞聚類(lèi)為3簇，窩狀黏液細(xì)胞1和窩狀黏液細(xì)胞2主要存在于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的標(biāo)本中，與腫瘤組織(T1)比較，在正常組織(N1)中含量略有增加。窩狀黏液細(xì)胞3主要富集于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的標(biāo)本中。使用受體-配體相互作用實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，窩狀黏液細(xì)胞3與癌細(xì)胞之間的相互作用最為明顯。窩狀黏液細(xì)胞3標(biāo)記基因CXCL5在窩狀黏液細(xì)胞3中特異性表達(dá)，見(jiàn)圖3。

A：不同亞簇的窩狀黏液細(xì)胞在標(biāo)本中的比例；B：細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)；C：CXCL5在不同細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)情況；D：CXCL5在3個(gè)窩狀黏液細(xì)胞亞簇中的表達(dá)情況。

2.4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)/陰性組胃癌組織XIST、CXCL5表達(dá)水平比較

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的胃癌組織中XIST、CXCL5表達(dá)水平均高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)/陰性組胃癌組織XIST、CXCL5表達(dá)水平比較

3 討 論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的最重要危險(xiǎn)因素之一，淋巴結(jié)清掃已被證明可以提高胃癌的生存率[5]。單細(xì)胞RNA測(cè)序可以更好地揭示細(xì)胞之間的異質(zhì)性，識(shí)別不同的細(xì)胞亞群，剖析細(xì)胞分化過(guò)程和細(xì)胞作用關(guān)系，目前，單細(xì)胞RNA測(cè)序在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的研究鮮有報(bào)道。因此，將單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移探尋有關(guān)的細(xì)胞學(xué)特征和相關(guān)分子標(biāo)志物等十分有必要。

本研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的主細(xì)胞亞聚類(lèi)——主細(xì)胞3，可能是胃腺癌轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志。上皮化生是胃癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要過(guò)程，主細(xì)胞的異常分化被認(rèn)為是導(dǎo)致上皮化生的主要原因[6-7]。解痙多肽表達(dá)化生(spasmolytic polypeptide expressing metaplasia,SPEM)作為胃癌癌前病變，有報(bào)道稱，發(fā)生化生時(shí)，主細(xì)胞會(huì)直接轉(zhuǎn)化為SPEM細(xì)胞，而當(dāng)化生消退時(shí)，SPEM細(xì)胞則會(huì)重新分化為主細(xì)胞[8]。本研究通過(guò)擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)了在假的時(shí)間軸上，存在主細(xì)胞2、主細(xì)胞3、主細(xì)胞1向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，主細(xì)胞2與正常主細(xì)胞標(biāo)記基因類(lèi)似，均高表達(dá)LIPF，而主細(xì)胞1和SPEM細(xì)胞相似，均高表達(dá)MUC6、SOX9[3]。作為正常的主細(xì)胞和SPEM細(xì)胞之間的中間狀態(tài)，主細(xì)胞3僅在淋巴轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的標(biāo)本中明顯富集，提示主細(xì)胞3可能是主細(xì)胞的一種新亞型，可以作為轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。有了這個(gè)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，繼續(xù)對(duì)主細(xì)胞3的差異富集基因XIST進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。XIST基因是哺乳動(dòng)物中X基因失活的主調(diào)控因子，據(jù)報(bào)道，XIST在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，并與更具有侵襲性的表型相關(guān)[9]。越來(lái)越多的研究表明，XIST異常上調(diào)與多種實(shí)體腫瘤的晚期腫瘤分期、分化差和生存期縮短直接相關(guān)[10]。整理文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)XIST在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究鮮有報(bào)道。本課題組對(duì)XIST進(jìn)行RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)XIST在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的胃癌組織中表達(dá)水平更高，提示XIST過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而提高腫瘤的惡性程度。

本研究發(fā)現(xiàn)窩狀黏液細(xì)胞3主要存在于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的標(biāo)本中，且在胃癌組織中明顯富集，通過(guò)細(xì)胞互作分析發(fā)現(xiàn)其與癌細(xì)胞相互作用強(qiáng)烈。同時(shí)GO分析顯示窩狀黏液細(xì)胞3差異基因富集的信號(hào)通路很多與細(xì)胞分離、細(xì)胞遷移相關(guān)，如細(xì)胞骨架蛋白綁定、有絲分裂細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等[11-12]。對(duì)其差異基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CXCL5為其標(biāo)記基因。CXCL5是實(shí)體瘤中腫瘤微環(huán)境中重要的趨化因子之一，研究發(fā)現(xiàn)其來(lái)源可能與腫瘤微環(huán)境中的腫瘤自分泌和旁分泌有關(guān)[13]。根據(jù)以往的研究，與相應(yīng)癌旁組織及正常組織比較，CXCL5在鼻咽癌、胃癌、結(jié)直腸癌等癌組織中表達(dá)水平明顯升高[14-16]。本課題組對(duì)CXCL5進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CXCL5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的胃癌組織中表達(dá)水平更高，提示CXCL5過(guò)表達(dá)能對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究將單細(xì)胞RNA測(cè)序應(yīng)用于胃癌淋巴轉(zhuǎn)移，確定了兩種可能對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用的細(xì)胞類(lèi)型——主細(xì)胞3和窩狀黏液細(xì)胞3，并對(duì)這兩種細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行差異基因鑒定，發(fā)現(xiàn)其標(biāo)記基因XIST、CXCL5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者的胃癌組織中明顯高表達(dá)，提示主細(xì)胞3、窩狀黏液細(xì)胞3及其標(biāo)記基因XIST、CXCL5有望成為預(yù)測(cè)胃癌淋巴轉(zhuǎn)移和治療的分子生物標(biāo)志物。