陶秀娟，劉賀榮，蔡慧珍，范彥娜，高清菡，楊建軍

(寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004)

近幾十年來，2型糖尿病的患病人數(shù)在全世界都明顯上升[1]。據(jù)估計到2040年，全球成年糖尿病患者的比例將增加到10.4%，即6.42億糖尿病患者[2]。近年來，關(guān)于鐵過載與糖尿病關(guān)系的研究已逐漸成為糖尿病相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點。體內(nèi)鐵過載可能是引起2型糖尿病發(fā)病的獨立危險因素之一，機體鐵儲存量愈多，發(fā)生葡萄糖耐量異常、2型糖尿病或妊娠糖尿病的風(fēng)險也愈大[3-5]。臨床研究或動物實驗均提示，機體鐵過載是糖尿病發(fā)病的危險因素，各種因素導(dǎo)致的鐵過載在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中均扮演著重要的角色[6-8]。體內(nèi)鐵含量的升高可導(dǎo)致葡萄糖代謝的紊亂，其機制可能與胰島素分泌受損或胰島素抵抗有關(guān)[9]。肝臟是鐵代謝的主要器官，也是鐵蓄積產(chǎn)生毒害的首要靶器官，鐵過載產(chǎn)生的活性氧通過肝臟激酶-B1/絲裂原活化蛋白激酶信號通路抑制胰島素受體在肝臟等組織中的磷酸化，降低胰島素受體的敏感度[10]。但肝臟鐵過載是否能引起肝細胞糖代謝關(guān)鍵酶活性的改變從而誘發(fā)肝臟糖代謝紊亂的相關(guān)報道尚少見。因此，本研究擬通過用不同濃度枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate,FAC)干預(yù)肝LO2細胞，探討鐵過載對LO2細胞活性氧水平及葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶購自上海逍鵬生物科技有限公司；FAC購自美國MedChemexpress生物科技公司；去鐵胺(desferrioxamine,DFO)購自美國Sigma-aldrich生物科技有限公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；人葡萄糖激酶(glucokinase,GK)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、人丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Multiskan GO型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；F-4600型熒光分光光度計(日本日立公司)。

1.1.2細胞株

人肝LO2細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所細胞庫，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁長至70%左右傳代，待細胞生長密度達到1×104個/mL時用于實驗。

1.2 方法

1.2.1LO2細胞分組與處理

取生長狀態(tài)良好LO2細胞胰酶消化后，取1×104/mL的細胞懸液，按檢測指標所需分別接種于無菌的96孔、12孔培養(yǎng)板內(nèi)。以含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，實驗分為5組，每組設(shè)5個復(fù)孔。(1)對照組：正常接種的LO2細胞+RPMI 1640培養(yǎng)基；(2)低劑量干預(yù)組：正常接種的LO2細胞+含7.5 mmol/L FAC的RPMI 1640培養(yǎng)基；(3)中劑量干預(yù)組：正常接種的LO2細胞+含75 μmol/L FAC的RPMI 1640培養(yǎng)基；(4)高劑量干預(yù)組：正常接種的LO2細胞+含750 μmol/L FAC的RPMI 1640培養(yǎng)基；(5)DFO處理組：正常接種的LO2細胞+含75 μmol/L FAC的RPMI 1640培養(yǎng)基干預(yù)18 h，加DFO(250 μmol/L)。

1.2.2檢測指標與方法

1.2.2.1LO2細胞活力檢測(CCK-8法)

取對數(shù)生長期LO2細胞，按照每孔5×103個細胞量接種于96孔板，待細胞貼壁后分5組干預(yù)。各組細胞每孔加入10 μL的CCK-8試劑，放入37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，酶標儀測定在450 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞活力(%)=[A(加藥)—A(空白)]/[A(0加藥)—A(空白)]×100。A(加藥):具有細胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的A值；A(空白):具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的A值；A(0加藥):具有細胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液的孔的A值。

1.2.2.2ELISA檢測LO2細胞GK、PK活性

取對數(shù)生長期LO2細胞按每孔2×106個接種于12孔板，預(yù)先置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后分組干預(yù)。將干預(yù)好的細胞從培養(yǎng)箱中拿出，胰蛋白酶消化后離心5 min(1 000 r/min)磷酸鹽緩沖液沖洗2次，并稀釋細胞懸液使?jié)舛冗_1×107/mL放入離心管。通過反復(fù)凍融，破壞細胞，2 000 r/min離心20 min，仔細收集上清液待檢。采用ELISA法，按照人GK、PK活性檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.2.3LO2細胞ROS水平檢測

取對數(shù)生長期LO2細胞按每孔2×106個接種于12孔板，預(yù)先置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后分組干預(yù)。按照ROS檢測試劑盒安裝熒光探針2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)后，收集細胞后用熒光分光光度計檢測，設(shè)置激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，檢測各組細胞熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 鐵過載對肝正常細胞LO2生物活性的影響

各組細胞活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.710，P=0.070)，見圖1。

圖1 鐵過載對肝LO2細胞活力的影響(n=4)

2.2 鐵過載對正常肝LO2細胞葡萄糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

中、高劑量干預(yù)組細胞GK活性低于對照組，高劑量干預(yù)組PK活性低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DFO處理組GK、PK活性高于中劑量干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2、3。

a：P<0.05，與對照組比較。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.3 鐵過載對正常肝LO2細胞活性氧水平的影響

高劑量干預(yù)組細胞內(nèi)ROS水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

鐵是人體必需的微量元素，在機體吸收、利用、儲存及循環(huán)利用過程中維持著穩(wěn)態(tài)水平。高鐵負荷和鐵代謝障礙疾病已經(jīng)被證明和糖代謝異常發(fā)病風(fēng)險的增高有關(guān)[11]。多個流行病研究顯示鐵過載與胰島素抵抗相關(guān)，其機制可能有多種[12-15]。

肝臟是鐵代謝的主要器官，也是鐵蓄積產(chǎn)生毒害的首要靶器官。肝鐵聚集與高鐵蛋白血癥、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝有關(guān)[16-17]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以不同濃度FAC干預(yù)肝LO2細胞，在各組細胞FAC干預(yù)后細胞活性無差異的前提下，檢測各組細胞ROS水平，發(fā)現(xiàn)高劑量干預(yù)組細胞內(nèi)ROS水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明LO2細胞鐵負荷達到一定水平后，打破了機體內(nèi)ROS產(chǎn)生與機體ROS自我清除之間的相對平衡，可能對細胞造成過氧化損傷。

GK是一種己糖激酶,特異性存在于胰島β細胞和成熟肝細胞中。前者是催化胰島素分泌的限速步驟，后者參與糖原合成，因此，在糖代謝中發(fā)揮著重要作用。在GK基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量致病突變。在臨床中，激活突變表現(xiàn)為先天性高胰島素血癥，而功能喪失突變會導(dǎo)致糖尿病[18]。通過GK傳感器的作用，人體不同細胞、器官形成了一個緊密調(diào)控和穩(wěn)定的葡萄糖穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),始終維持人體血糖穩(wěn)態(tài)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，GK在中、高劑量干預(yù)組活性下降，而在DFO處理組GK活性有所上升，可能的原因是DFO通過螯合鐵離子，降低了細胞ROS的產(chǎn)生，避免其對細胞產(chǎn)生氧化損傷，從而降低了鐵對GK活性的影響。

PK是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，催化磷酸烯醇式丙酮酸形成丙酮酸并生成ATP[20]。本研究發(fā)現(xiàn)PK在高劑量干預(yù)組活性下降。當肝細胞內(nèi)GK與PK活性下降時，會導(dǎo)致糖原合成與葡萄糖利用減少，最終引起糖代謝紊亂，與胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[21]。

綜上所述，75、750 μmol/L FAC干預(yù)的細胞內(nèi)GK、PK活性降低，可能是導(dǎo)致細胞糖代謝紊亂的原因之一，但其機制也有待進一步研究。