陳艷霞，涂衛(wèi)平，房向東，柯 本，龍 脈，黃金菁

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，南昌 330006)

傳統(tǒng)上認(rèn)為糖尿病腎病是血流動(dòng)力學(xué)和代謝因素相互作用的結(jié)果，但研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病動(dòng)物模型和糖尿病腎病患者中循環(huán)炎性因子的表達(dá)明顯上調(diào)，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加，黏附分子和趨化因子水平表達(dá)增加[1]，表明炎癥參與糖尿病腎病的發(fā)生及進(jìn)展。目前關(guān)于糖尿病腎病的研究表明其發(fā)病機(jī)制是多因素的，其中免疫反應(yīng)和炎癥起主要作用[2]。促炎信號(hào)通路及其下游產(chǎn)物正成為糖尿病腎病新的生物標(biāo)志物和有前景的治療靶點(diǎn)。研究觀察發(fā)現(xiàn)，益腎化濕顆粒具有降低糖尿病腎病患者炎性因子的作用，但其具體機(jī)制不明確[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，其炎性因子如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6等的表達(dá)明顯增加，其機(jī)制與RhoA/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK1)信號(hào)通路有關(guān)，提示RhoA/ ROCK1信號(hào)通路參與糖尿病腎病的炎癥發(fā)病機(jī)制[4]。因此，本研究擬探討益腎化濕顆粒通過(guò)RhoA/ROCK1信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病炎癥的影響及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，10～12周齡，體重(380±20)g；益腎化濕顆粒：成分包含人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗，規(guī)格為10 g/袋，獲贈(zèng)于廣州康臣藥業(yè)有限公司；ELISA試劑盒購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；Western blot檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備與分組

60只SD清潔級(jí)雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后分為對(duì)照組、糖尿病腎病組和干預(yù)組，每組20只。糖尿病腎病組與干預(yù)組大鼠采用腹腔注射佐鏈霉素(60 mg/kg)制備糖尿病腎病模型，注射佐鏈霉素72 h后檢測(cè)空腹血糖，若≥16.7 mmol/L為糖尿病模型建立成功。對(duì)照組予以普通飼料喂養(yǎng)，糖尿病腎病組與干預(yù)組予以高脂高糖喂養(yǎng)，糖尿病腎病造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)2次空腹血糖≥16.7 mmol/L、24 h尿蛋白排泄率>30 mg，繼續(xù)喂養(yǎng)至8周后進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.2.2干預(yù)方法

采用灌胃給藥，干預(yù)組予以益腎化濕顆粒(5 g/kg)，按0.2 mL/10 g體重進(jìn)行灌胃，每天1次；對(duì)照組及糖尿病腎病組給予等量0.9%生理鹽水進(jìn)行灌胃；干預(yù)期間均采用普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，自由飲水，不使用任何降糖治療，干預(yù)時(shí)間為4周。

1.2.3標(biāo)本留取

留取大鼠尾靜脈全血測(cè)血糖、血肌酐、核因子-κB(nuclear factor Kappa-B,NF-κB)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)；收集24 h尿液測(cè)24 h尿蛋白定量(全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定)；干預(yù)結(jié)束后各組SD大鼠處死，無(wú)菌留取腎臟，取部分腎組織于10%甲醛固定后進(jìn)行光鏡的觀察，其余腎組織采用液氮保存用于Western blot檢測(cè)。

1.2.4ELISA檢測(cè)

全血離心，取血清進(jìn)行NF-κB、IL-6、TNF-α表達(dá)水平的檢測(cè)，按NF-κB、IL-6、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，獲取吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NF-κB、IL-6、TNF-α表達(dá)水平。

1.2.5Western blot檢測(cè)

從液氮中取部分預(yù)留的腎組織，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯(PDVF)膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加抗體孵育過(guò)夜。取出后使用TBST液進(jìn)行沖洗，使之結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對(duì)RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6蘇木素-伊紅(HE)染色

取SD大鼠腎組織，用4%甲醛浸泡，24 h后常規(guī)石蠟包埋并連續(xù)切片。脫蠟處理后放入不同濃度的乙醇中各復(fù)水3 min，蘇木素染色15 min，清洗3次后鹽酸乙醇分化處理30 s，1%伊紅染色，脫水處理后脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型建立前3組大鼠一般情況比較

動(dòng)物模型建立前，3組大鼠體重、血糖、血肌酐比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)物模型建立前3組大鼠一般情況比較

2.2 藥物干預(yù)前3組大鼠一般情況比較

藥物干預(yù)前，與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)組與糖尿病腎病組以上指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 藥物干預(yù)前3組大鼠一般情況比較

2.3 藥物干預(yù)后3組大鼠一般情況比較

藥物干預(yù)后，與糖尿病腎病組比較，干預(yù)組24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 藥物干預(yù)后3組大鼠一般情況比較

2.4 藥物干預(yù)后3組大鼠腎臟病理變化情況

對(duì)照組腎組織的腎小球結(jié)構(gòu)完整，皮、髓質(zhì)分界清楚，系膜、基質(zhì)未見(jiàn)明顯增生。糖尿病腎病組腎小球體積增大，部分系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞數(shù)目有增加，可見(jiàn)部分毛細(xì)血管管腔變形擴(kuò)張；腎小管擴(kuò)張明顯，小管細(xì)胞肥大，管腔變窄，部分伴有小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，提示糖尿病腎病中晚期的改變。干預(yù)組大鼠腎小球系膜增生較糖尿病腎病組略有減輕，見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組；B：糖尿病腎病組；C：干預(yù)組。

2.5 藥物干預(yù)后3組大鼠腎組織相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與糖尿病腎病組比較，干預(yù)組腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

a:P<0.05。

3 討 論

炎癥已成為糖尿病腎病的重要病理生理機(jī)制，慢性微炎癥和免疫系統(tǒng)激活在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。腎組織中NF-κB的活化在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，NF-κB易位進(jìn)入細(xì)胞核并觸發(fā)靶基因的表達(dá)，導(dǎo)致持續(xù)并逐漸增強(qiáng)的炎癥表達(dá)不斷增加，最終導(dǎo)致腎臟纖維連接蛋白的過(guò)度表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，加劇腎功能的惡化。

Rho蛋白屬于Ras蛋白超家族成員之一，是一組分子量為20×103～30×103的GTP結(jié)合蛋白，其作用與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變相關(guān)，與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞黏附、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)行為也有密切聯(lián)系。被激活的Rho蛋白的靶效應(yīng)器是Rho激酶，即ROCK，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是Rho下游靶效應(yīng)分子中功能研究最為清楚的。ROCK由兩種同源性極高的異構(gòu)體構(gòu)成，ROCK1和ROCK2，腎組織中高表達(dá)ROCK1。阻斷糖尿病鼠的RhoA/ROCK通路后可以改善腎小球的通透性[5]和腎臟的血流動(dòng)力學(xué)[6]。多項(xiàng)研究證實(shí)糖尿病腎病患者體內(nèi)的RhoA/ROCK的激活增加，阻斷RhoA/ROCK信號(hào)通路后可以顯示出其腎保護(hù)作用[7]，均提示RhoA/ROCK信號(hào)通路參與糖尿病腎病進(jìn)展的過(guò)程。

在本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活化受RhoA/ROCK信號(hào)通路的調(diào)控[8]。QIAN等[9]在心肌缺血再灌注損傷的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制RhoA/ROCK/NF-κB途徑，可以抑制炎性因子的表達(dá)，從而對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。另有研究表明，抑制RhoA/NF-κB途徑，可以抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物對(duì)糖尿病腎病患者足細(xì)胞的損傷，成為糖尿病腎病潛在的治療新靶點(diǎn)[10]。

益腎化濕顆粒由人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗等藥組成，具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用。主要成分黃芪能明顯提高其網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬功能[11]。茯苓能激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)，減弱成纖維細(xì)胞激活和異常細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，降低尿蛋白[12]。劉孝琴等[13]研究發(fā)現(xiàn)益腎化濕顆?？赡芡ㄟ^(guò)降低早期糖尿病腎病患者高敏C反應(yīng)蛋白和IL-8的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，從而對(duì)早期糖尿病腎病有一定的保護(hù)作用。沈文清等[14]以60例慢性腎臟病2～3期患者為研究對(duì)象，治療組口服益腎化濕顆粒，對(duì)照組口服中成藥腎衰寧片，觀察時(shí)間為6個(gè)月，治療組治療后高敏C反應(yīng)蛋白、IL-6、TNF-α均較治療前下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組治療前后高敏C反應(yīng)蛋白、IL-6、TNF-α水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示益腎化濕顆?？筛纳坡阅I臟病2～3期患者的微炎癥狀態(tài)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)益腎化濕顆粒干預(yù)患有糖尿病腎病的SD大鼠后，SD大鼠的24 h尿蛋白定量有一定程度下降，提示益腎化濕顆粒具有降低尿蛋白的作用，與益腎化濕顆粒治療糖尿病腎病有效性與安全性meta分析的結(jié)果一致[15]。且干預(yù)后的SD大鼠血清中NF-κB、IL-6、TNF-α的表達(dá)及腎組織中NF-κB、IL-6、TNF-α的表達(dá)均有下降，說(shuō)明出益腎化濕顆粒具有下調(diào)炎性因子表達(dá)從而發(fā)揮腎保護(hù)作用。糖尿病腎病組SD大鼠腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，提示在糖尿病腎病的過(guò)程過(guò)中，RhoA/ROCK1/NF-κB信號(hào)通路被激活。予以益腎化濕顆粒干預(yù)后，干預(yù)組SD大鼠腎組織RhoA、ROCK1、NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，推理出益腎化濕顆?？赡芡ㄟ^(guò)RhoA/ROCK1/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控下游IL-6、TNF-α等炎性因子的表達(dá)，減輕糖尿病腎病的炎癥狀態(tài)，從而達(dá)到降低尿蛋白，改善腎功能的作用。目前本研究?jī)H對(duì)益腎化濕顆粒的給藥劑量5 g/kg進(jìn)行研究，藥物干預(yù)時(shí)間點(diǎn)為4周，不同的劑量及藥物干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的作用有待于進(jìn)一步的探究。

綜上所述，在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，RhoA/ROCK1/NF-κB信號(hào)通路被激活，成為糖尿病腎病防治的新靶點(diǎn)，益腎化濕顆粒能夠部分抑制RhoA/ROCK1/NF-κB信號(hào)通路，改善糖尿病腎病的炎癥狀態(tài)，具有延緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病進(jìn)展的潛在價(jià)值。深入研究益腎化濕顆粒在糖尿病腎病中的機(jī)制，有望獲得更高的臨床應(yīng)用價(jià)值。