王新強，吳良邦，章月紅，顧增輝

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第903醫(yī)院骨三科，杭州 310004)

番茄紅素(lycopene，LP)是一種屬于類胡蘿卜素家族的膳食抗氧化劑，可在紅色和黃色水果或植物中合成[1]。主要存在于胡蘿卜、西瓜、木瓜、蘆筍和歐芹中[2]。LP(化學式為C40H56)是一種親油性四萜，具有共軛雙鍵結構[3]。LP具有多種功能，包括抗炎、抗氧化和抗增殖，可預防或治療心力衰竭、腫瘤。LP可通過抑制氧化應激、神經(jīng)元凋亡和炎癥及恢復線粒體功能表現(xiàn)出治療作用，這其中包括帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、癲癇和抑郁癥及恢復嚙齒動物的記憶能力[4]。LP還可以有效預防和治療心血管疾病和癌癥。其中在降低肺癌和前列腺癌風險方面起到了明顯的預防作用[5]。但LP在骨肉瘤中的作用及其潛在機制鮮有文獻報道，本研究旨在通過體外試驗觀察LP對人骨肉瘤MG63細胞的作用，并通過荷瘤裸鼠模型探討其對荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響及潛在機制，為尋找骨肉瘤的治療方法提供新思路，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

50只雄性裸鼠，體重(23.26±2.56)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SYXK(京)2017-0033。LP(純度≥98%，南京澤朗生物科技有限公司)；注射用順鉑(DDP，山東齊魯制藥有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS，美國HyClone公司)；MTT、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；PI-RNase A試劑(美國Trevigen公司)；組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑(美國Roche Molecular Biochemicals公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國Life Technologies公司)；Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate底物發(fā)光系統(tǒng)(美國Millipore公司)；鼠抗兔小GTPase RhoA和Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)一抗、辣根過氧化物酶耦聯(lián)的兔二抗(美國CST公司)；Luminescent圖像分析儀LAS-4000mini用于分析顯影結果(美國GE Healthcare公司)；酶標儀、流式細胞儀(美國Biorad公司)；BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；DYY-11型多用電泳儀、DYCZ-40B轉印泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1分組

MG63人骨肉瘤細胞購自美國ATCC細胞庫，在混合10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL后分為對照組、LP 5、10、20 μg/mL組和DDP(40 μg/mL)組[6]。各組細胞分別給予LP或DDP處理48 h進行后續(xù)試驗。

1.2.2細胞增殖

調(diào)整細胞濃度至5×104個/mL，轉移至96孔板，每孔滴加MTT溶液(5 mg/mL，20 μL)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除細胞上清液后添入DMSO 200 μL，常溫下振蕩10 min后在570 nm處波長下用酶標儀測定吸光度(A)值。細胞增殖抑制率(%)計算公式為：抑制率(%)=[1—(實驗組A值—空白組A值)/(對照組A值—空白組A值)]×100%。

1.2.3流式細胞術

收集每組處理后的細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次。對于細胞周期檢測，在—20 ℃下用乙醇固定細胞，再將細胞置于PI-RNaseA試劑中室溫下孵育25 min后，用PBS洗滌染色的細胞并通過流式細胞儀分析。對于細胞凋亡測定，收集處理過的細胞后，將它們用Annexin V-FITC/PI在25 ℃避光條件下染色25 min。用PBS洗滌2次后，被染色的細胞用于細胞凋亡分析。

1.2.4移植瘤模型建立

參照之前的方法[7]制備荷瘤鼠模型：收集對數(shù)生長期DMEM高糖培養(yǎng)的人骨肉瘤MG63細胞，制備濃度為5×106/mL的單細胞懸液，在無菌條件下于背部后部皮下接種(0.2 mL，1×106個細胞)。50只模型裸鼠分為5組：模型組，LP 10、20、40 mg·kg-1·d-1組和DDP(2 mg/kg)組，每組10只。造模成功后通過LP或DDP腹腔給藥，持續(xù)14 d[8]。抑瘤率計算方法為：抑瘤率(%)=(模型組瘤質量—實驗組瘤質量)/模型組瘤質量×100%。

1.2.5蛋白免疫印跡

用冷PBS洗滌骨肉瘤組織，用組織蛋白裂解液混合蛋白酶抑制劑的混合物裂解。在冰上孵育30 min后，4 ℃下以12 000×g離心15 min后收集上清液，并使用BCA法測定蛋白質濃度。含有等量總蛋白的(20 μg)的樣品通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉移到PVDF膜上。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后與對應一抗混合孵育4 ℃過夜。隨后，將膜與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的兔二抗一起孵育。使用高度靈敏的底物發(fā)光系統(tǒng)檢測抗體結合蛋白條帶，Luminescent圖像分析儀LAS-4000mini用于分析顯影結果。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 LP對MG63細胞增殖抑制率的影響

與對照組比較，LP 5、10、20 μg/mL組和DDP組MG-63細胞增殖抑制率均明顯升高(P<0.05)，且LP 20 μg/mL組細胞增殖抑制率明顯高于DDP組(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與DDP組比較。

2.2 LP對MG63細胞周期的影響

與對照組比較，LP 5、10、20 μg/mL組和DDP組MG-63細胞周期G0/G1期明顯延長(P<0.05)，S期和G2/M期明顯縮短(P<0.05)。與DDP組比較，LP 20 μg/mL組細胞在上述細胞周期的改變更為明顯(P<0.05)，見圖2。

A.流式細胞術檢測LP和DDP對MG63細胞周期的分布改變；B.各組細胞周期統(tǒng)計分析結果；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與DDP組比較。

2.3 LP對MG63細胞凋亡的影響

與對照組比較，LP 5、10、20 μg/mL組和DDP組MG-63細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05)，且LP 20 μg/mL組MG-63細胞凋亡率明顯高于DDP組(P<0.05)，見圖3。

A.流式細胞術檢測LP和DDP對MG63細胞凋亡的改變；B.各組細胞凋亡統(tǒng)計分析結果；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與DDP組比較。

2.4 LP對各組裸鼠荷瘤質量和抑瘤率的影響

與模型組比較，LP 20、40 mg·kg-1·d-1組和DDP組瘤質量明顯降低、抑瘤率明顯升高(P<0.05)；LP 40 mg·kg-1·d-1組瘤質量和抑瘤率與DDP組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1、圖4。

表1 各組裸鼠瘤質量和抑瘤率比較

圖4 各組裸鼠瘤體比較

2.5 LP對各組裸鼠荷瘤組織中RchoA和ROCK蛋白表達的影響

與模型組比較，LP 10、20和40 mg·kg-1·d-1組和DDP組RchoA和ROCK蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；LP 40 mg·kg-1·d-1組與DDP組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

a：P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

有研究表明，在人結腸癌細胞系HT-29細胞的體外研究中，LP可以通過抑制糖原合酶激酶-3β的磷酸化來抑制癌細胞的侵襲和基質金屬蛋白酶-7、Akt和細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2的表達。在前列腺癌PC3細胞系中，LP可通過降低AKT2的表達、增加microRNA Lethal-7的表達來阻止細胞增殖和誘導細胞凋亡[9]。本研究中，LP能夠阻滯MG-63細胞周期于G0/G1期，抑制細胞增殖和促進凋亡；體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，LP能夠抑制荷瘤裸鼠的腫瘤生長、提高抑瘤率。這說明LP對骨肉瘤細胞的細胞增殖和腫瘤生長均具有一定的抑制作用。

RhoA是Rho家族的小GTPase蛋白成員，已被證明是癌癥進展中的關鍵信號通路[10]。WANG等[11]研究表明RhoA/ROCK信號通路的激活可以促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲。此外，RhoA/ROCK信號通路可以參與血管形成并限制非小細胞肺癌的侵襲[12-13]。LIN等[14]研究表明CXCR4可以促進RhoA GTPase的激活和ROCK1的磷酸化。本研究中，LP劑量組RchoA和ROCK蛋白表達明顯下調(diào)，其對RhoA/ROCK信號通路的作用與順鉑組相似，這可能是LP促進荷瘤組織細胞凋亡而抑制腫瘤生長的重要分子機制之一。

綜上所述，LP可抑制體外人骨肉瘤MG-63細胞增殖、細胞周期，促進細胞凋亡，還可抑制骨肉瘤裸鼠腫瘤生長，其機制可能與LP抑制RhoA/ROCK信號通路有關。