喬鳳昌，程 青，張翠平，許爭(zhēng)峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，南京市婦幼保健院，南京 210004)

Joubert綜合征是一種罕見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床典型特征為小腦蚓部發(fā)育不全或缺如、肌張力減退、眼部運(yùn)動(dòng)和呼吸異常、不同程度的智力低下及生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等。影像學(xué)磁共振成像為“臼齒狀”，即由伸長(zhǎng)的小腦上腳和增寬的腳間窩構(gòu)成[1]。目前已發(fā)現(xiàn)35個(gè)致病基因，主要遺傳方式為常染色體隱性遺傳，也有性染色體遺傳，具有臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性[2]。因此，臨床上對(duì)于Joubert綜合征的診斷具有一定難度。本研究用外顯子測(cè)序技術(shù)(exome sequencing,ES)對(duì)患腦積水的胎兒進(jìn)行基因測(cè)序分析以明確其病因，為家系的遺傳咨詢(xún)、再次妊娠提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 孕婦，27歲，G2P0。孕18周因“產(chǎn)前超聲檢查提示胎兒腦部發(fā)育不良”于2020年12月28日于南京市婦幼保健院就診。孕婦本次妊娠為自然受孕，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院早期NT檢查提示小腦延髓池稍寬，約4mm，胎兒NT<第95th百分位，建議16周復(fù)查超聲。孕16+2周于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院復(fù)查超聲提示側(cè)腦室寬4mm，小腦延髓池明顯增寬，約7mm，雙側(cè)小腦半球明顯變小，未探及小腦蚓部回聲。孕18周本院復(fù)查超聲提示胎兒顱后窩增寬約1.2cm，小腦蚓部未能清晰顯示，小腦半球顯示不完整，Dandy-Walker綜合征不能排除。孕婦曾于2019年因“孕20周，胎兒腦積水，右足內(nèi)翻可能”于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院引產(chǎn)1次，引產(chǎn)胎兒染色體微陣列檢查結(jié)果未見(jiàn)異常。否認(rèn)家族遺傳病史，否認(rèn)近親婚配。夫妻雙方及其他成員均未見(jiàn)異常表型，家系圖見(jiàn)圖1A。

圖1 家系圖和Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果A:家系圖；B:外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出患兒TMEM216基因c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)的復(fù)合雜合突變；C:Sanger測(cè)序驗(yàn)證患兒TMEM216基因的復(fù)合雜合突變

經(jīng)遺傳咨詢(xún)和簽署知情同意書(shū)后，分別采集胎兒羊水15mL和父母外周血5mL，提取DNA后進(jìn)行外顯子測(cè)序檢測(cè)基因突變情況。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 全外顯子測(cè)序 采用家系的方式對(duì)胎兒及父母進(jìn)行檢測(cè)。DNA樣本經(jīng)過(guò)超聲隨機(jī)打斷為300～600bp大小，采用Agilent SureSelect XT Library Prep Kit建庫(kù)試劑盒和Agilent SureSelect XT Human All Exon V6 kit捕獲試劑盒(Agilent,Santa Clara,CA,USA)對(duì)樣本進(jìn)行建庫(kù)和外顯子捕獲。富集的捕獲區(qū)域通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序(Illumina Hiseq 2500平臺(tái)，2×150bp讀長(zhǎng)模式)[3]。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner,v 0.7)軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組序列(GRCh37/hg19),samtool(v 0.1.18)軟件去除PCR重復(fù)序列后分別使用GATK(v 4.0)和Annovar軟件獲取位點(diǎn)變異和注釋信息。過(guò)濾掉最小等位基因頻率(GenomAD數(shù)據(jù)庫(kù))>0.5%的位點(diǎn)后，根據(jù)軟件(Revel,Mutationtaster,Human Splicing Finder等)預(yù)測(cè)蛋白的功能改變、基因與表型關(guān)系(HPO數(shù)據(jù)庫(kù))、遺傳方式(OMIM數(shù)據(jù)庫(kù))、家系共分離情況等綜合考慮確定候選致病基因和位點(diǎn)。根據(jù)ACMG(2015)原則對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性判斷[4]。

1.2.3 Sanger測(cè)序 使用NCBI在線軟件(Primer-Blast,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=Blast Home)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增TMEM216(NM_001173990.3)基因的引物，并由金唯智公司合成。針對(duì)c.357_359dup(p.I119.dup)的引物序列：上游5'-TCACATCTCCCACGCCTTTC-3',下游5'-AGAAATGGTCCCTCAGCAGC-3',退火溫度60℃,產(chǎn)物大小304bp。針對(duì)c.217C>T(p.R73C)的引物序列：上游5'-TTCCCAAGTGTGTGGCAGTT-3',下游5'-GCCCTGACGTGGAGTTACAA-3',退火溫度60℃,產(chǎn)物大小487bp。反應(yīng)條件95℃ 10min;95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,共35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送金唯智公司進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 外顯子測(cè)序結(jié)果 患兒外顯子測(cè)序捕獲效率為73.02%，目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度96.98×，其中測(cè)序深度20×以上的區(qū)域占目標(biāo)捕獲區(qū)域的97.61%，覆蓋度良好。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在TMEM216基因(NM_001173990.3)上存在復(fù)合雜合突變。分別為第3號(hào)外顯子c.217C>T(p.R73C)的雜合突變，遺傳自父親；第4號(hào)外顯子c.357_359dup(p.I119.dup)的雜合突變，遺傳自母親(圖1B)。c.217C>T(p.R73C)位點(diǎn)在GnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中的人群頻率為0.000028(PM2)；據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有患者中檢出該變異[5-9](PM3_P)；該變異與致病變異c.218G>T(p.R73L)、c.218G>A(p.R73H)在同一位置有不同的氨基酸改變(PM5_S)；對(duì)之前引產(chǎn)的胎兒留存的DNA進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)前一胎患兒同樣遺傳此位點(diǎn)(PP1)。根據(jù)ACMG(2015)指南，該變異判讀為疑似致病變異(PM2+PM3_P+PM5_S+PP1)；c.357_359dup(p.I119.dup)位點(diǎn)在GnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄(PM2)；反式位置有疑似致病性突變(PM3)；該變異為非重復(fù)區(qū)框內(nèi)插入，導(dǎo)致多肽鏈的長(zhǎng)度發(fā)生改變(PM4)；前一胎患兒同樣遺傳此位點(diǎn)(PP1)。根據(jù)ACMG指南，該變異判讀為疑似致病變異(PM2+PM3+PM4+PP1)。OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)顯示該基因的突變會(huì)導(dǎo)致Joubert綜合征2型。

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 兩個(gè)胎兒的TMEM216基因均存在c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)的復(fù)合雜合突變，分別遺傳自父母，與外顯子測(cè)序結(jié)果一致(圖1C)。

3 討 論

Joubert綜合征的發(fā)病與纖毛結(jié)構(gòu)及功能異常、Shh信號(hào)通路相關(guān)，臨床異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性較強(qiáng)，涉及35個(gè)基因，同一個(gè)基因的變異會(huì)引起不同表型，不同基因可能導(dǎo)致相同的表型；根據(jù)受累器官的差別分為6種亞型：?jiǎn)渭冃?、合并眼缺陷型、合并視網(wǎng)膜缺陷型、合并肝臟缺陷型、合并腎缺陷型和伴有口面部畸形[2]。因此，臨床上對(duì)Joubert綜合征進(jìn)行鑒別診斷相當(dāng)困難。超聲影像學(xué)檢測(cè)具有非特異性和不敏感性，當(dāng)有表型與其他疾病重疊時(shí)則無(wú)法做出診斷。胎兒除了明顯的結(jié)構(gòu)異常和軟指標(biāo)異常外，其他異常(如生理性的異常)超聲檢查無(wú)法檢出，且胎兒期無(wú)法表現(xiàn)出疾病應(yīng)有的表型?？紤]到孕婦連續(xù)兩胎均有類(lèi)似的癥狀可能為遺傳因素導(dǎo)致，因此采用外顯子測(cè)序技術(shù)為患者尋找致病原因。

通過(guò)外顯子測(cè)序技術(shù)對(duì)本次胎兒及父母進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胎兒TMEM216基因的復(fù)合雜合突變，分別遺傳自父母，父母決定終止妊娠。TMEM216基因(NM_001173990.3)位于11q12.2，含有5個(gè)外顯子，編碼145個(gè)氨基酸，形成的蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域。Valente等在胎兒組織中首次鑒定，原位雜交結(jié)果顯示TMEM216在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢芽、腎臟和軟骨中表達(dá)，在小鼠的內(nèi)髓集尿管細(xì)胞、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和近端腎小管上特異性表達(dá)，定位于初生纖毛的基部或臨近的基體部，是纖毛的組裝和功能所必需[5]。目前研究顯示，TMEM216基因有127個(gè)變異，包含錯(cuò)義突變、剪切位點(diǎn)突變、移碼突變、內(nèi)含子突變等(數(shù)據(jù)來(lái)源于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù):https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TMEM216&keywords=TMEM216#snp)，但目前尚無(wú)產(chǎn)前的病例報(bào)道。TMEM216基因突變屬于常染色隱性遺傳模式，該病例存在復(fù)合雜合突變，分別位于c.217C>T(p.R73C)和c.357_359dup(p.I119.dup)。錯(cuò)義突變c.217C>T(p.R73C)和框內(nèi)插入變異c.357_359dup(p.I119.dup)位于Transmemb_17結(jié)構(gòu)域，變異破壞了蛋白的跨膜功能，前者已有致病性報(bào)道[6-9]，后者為新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)。根據(jù)ACMG原則可對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)做出可疑致病的判斷，患兒診斷為Joubert綜合征2型患者。Joubert綜合征2型除了有腦部典型特征外，還可有肌張力減退、眼球震顫、斜視和腎功能障礙等特點(diǎn)[10]，但因患者為產(chǎn)前的胎兒，因此其他癥狀無(wú)法檢出或暫時(shí)沒(méi)有表型。此家系中兩個(gè)胎兒均遺傳了父母攜帶的雜合突變，父母再生育時(shí)需進(jìn)行植入前產(chǎn)前診斷排除致病位點(diǎn)或自然妊娠，但自然妊娠的胎兒有25%概率仍遺傳此復(fù)合雜合變異，需妊娠期進(jìn)行產(chǎn)前診斷。同時(shí)提示連續(xù)兩胎具有類(lèi)似癥狀的患兒，其患隱性遺傳病的可能性較大。

本研究中夫妻曾有過(guò)一次不良孕產(chǎn)史，且染色體芯片結(jié)果未見(jiàn)異常，因此對(duì)于本次具有類(lèi)似表型的胎兒直接進(jìn)行外顯子測(cè)序，這種策略也符合ISPD最新的聲明[11]。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)連續(xù)兩次不良生育史的家庭其患兒的遺傳學(xué)病因是父母的復(fù)合雜合突變導(dǎo)致。Wang等[12]對(duì)連續(xù)兩次羊水過(guò)多胎兒進(jìn)行外顯子測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胎兒系LMOD3的c.1412delA(p.Lys471Serfs*18)和c.1283dupC(p.Gly429Trpfs*)變異引起的線狀體肌病。Wang等為兩個(gè)異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良患兒尋找到致病性原因是ARSA基因的c.302G>T和c.1344dupC復(fù)合雜合變異[13]。同時(shí)，Chitty等綜合分析了文獻(xiàn)報(bào)道的4350余例各系統(tǒng)畸形胎兒采用外顯子測(cè)序后的異常檢出情況，發(fā)現(xiàn)417例神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒在核型/染色體芯片檢出陰性后進(jìn)行外顯子測(cè)序進(jìn)一步確診的為17%(12%～22%)[14]。對(duì)于產(chǎn)后神經(jīng)系統(tǒng)異常的患者，神經(jīng)系統(tǒng)疾病專(zhuān)家組分析了30篇已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)外顯子測(cè)序的檢出率為36%，單純神經(jīng)系統(tǒng)異?；颊叩臋z出率為31%，合并其他系統(tǒng)異常的檢出率高達(dá)53%[15]。因此，外顯子測(cè)序技術(shù)為神經(jīng)系統(tǒng)異常胎兒/患者尋找遺傳學(xué)病因的一項(xiàng)有效手段。

綜上所述，采用外顯子測(cè)序技術(shù)為患有Joubert綜合征2型的胎兒提供了遺傳學(xué)診斷，同時(shí)拓展了Joubert綜合征的致病基因變異譜，為該綜合征的遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前診斷和再次妊娠提供了理論依據(jù)，進(jìn)一步證實(shí)了外顯子測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常胎兒中應(yīng)用的可行性及價(jià)值。