魏友華，馬兆文，仇雪梅，趙淑芹*

(山東省棗莊市婦幼保健院 a.醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前篩查科;b.生殖遺傳中心,棗莊 277000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種較常見的女性內(nèi)分泌性疾病，發(fā)病率約占育齡女性的5%～10%，是無排卵性不育的主要病因。PCOS的基本特征是長(zhǎng)期不排卵或稀發(fā)排卵、高胰島素血癥、卵巢多囊樣改變、高雄激素血癥以及女性生育力降低。目前PCOS的發(fā)生機(jī)制并不十分明確，不少研究表明雄激素過多可能是導(dǎo)致PCOS的根本原因之一[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)了眾多的PCOS相關(guān)差異表達(dá)基因[2]，但高雄激素發(fā)揮作用的直接效應(yīng)基因或PCOS發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵基因以及雄激素通過何種機(jī)制調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，目前尚不清楚。雄激素的功能發(fā)揮需與雄激素受體(androgen receptor,AR)結(jié)合。雄激素受體是一種轉(zhuǎn)錄因子，能識(shí)別靶因子上專一的DNA序列并與之結(jié)合，從而調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。PCOS患者卵泡發(fā)育障礙，卵子的發(fā)生是通過卵母細(xì)胞與其所處的卵泡微環(huán)境之間相互作用而獲得。卵泡液中多種細(xì)胞因子及激素的產(chǎn)生主要依賴于卵巢顆粒細(xì)胞，其在卵子發(fā)生過程中起著重要作用。卵巢顆粒細(xì)胞的任何異常變化均可能導(dǎo)致PCOS患者卵泡發(fā)育異常，引起“多囊卵巢”的表現(xiàn)。多項(xiàng)研究認(rèn)為，PCOS患者在高雄激素血癥作用下顆粒細(xì)胞凋亡異常增加[3-4]。本研究以顆粒細(xì)胞系為研究對(duì)象，從雄激素受體作為轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)屬性的角度出發(fā)，首次通過染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)(ChIP-Seq)的方法研究雄激素通過其受體可能結(jié)合的基因及信號(hào)通路，有助于從源頭上揭示雄激素參與PCOS發(fā)病機(jī)理的機(jī)制，并提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN細(xì)胞用DMEM/F 12培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中常規(guī)加10%胎牛血清、青霉素100U/mL、鏈霉素100U/mL，置37℃、5% CO2、95%濕度下培養(yǎng)。

1.2 藥物處理 本課題組前期研究應(yīng)用不同濃度梯度的睪酮(0、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)處理KGN細(xì)胞，結(jié)果表明，高濃度睪酮(10-5mol/L)處理后，顆粒細(xì)胞凋亡顯著增加。故本研究采用10-5mol/L睪酮濃度模擬高雄激素的作用。KGN細(xì)胞在37℃、5% CO2、95%濕度下培養(yǎng)于DMEM/F 12培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至30%～50%匯合率時(shí)，分別應(yīng)用溶劑(二甲基亞砜，對(duì)照組)或高濃度睪酮(10-5mol/L)處理48h，收集細(xì)胞用于后續(xù)的染色質(zhì)免疫共沉淀分析。睪酮、二甲基亞砜(DMSO)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 染色質(zhì)免疫共沉淀 用1%甲醛處理細(xì)胞，使DNA-蛋白質(zhì)的相互結(jié)合作用被交聯(lián)固定，裂解細(xì)胞，得到全細(xì)胞裂解液，超聲處理，將基因組DNA打斷至100～500bp碎片，打斷后的樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。細(xì)胞裂解液中加雄激素受體AR的抗體(PG21,06-680,Sigma EMD Millipore,Darmstadt,Germany)和beads，4℃孵育。洗脫，并解交聯(lián)，經(jīng)交聯(lián)反轉(zhuǎn)和蛋白酶K處理，DNA被沉淀提取出，再準(zhǔn)備構(gòu)建DNA文庫(kù)。

1.4 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析 文庫(kù)測(cè)序及質(zhì)控按Illumina標(biāo)準(zhǔn)流程操作。使用Illumina樣品準(zhǔn)備包對(duì)DNA片段進(jìn)行處理，包括末端修復(fù)、添加接頭和片段大小選擇，構(gòu)建DNA文庫(kù)(VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina,V2ND606-01)，進(jìn)行高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)的讀取(Illumina HiSeq PE150)。高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析由武漢愛基百客生物科技有限公司完成。

信息分析主要分為5部分：第一部分，數(shù)據(jù)預(yù)處理。去接頭序列、污染序列、低質(zhì)量堿基，獲得可用于分析的序列(clean data)，并進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。第二部分，clean data定位到參考基因組，得到后綴名為bam文件，去除重復(fù)序列，保留唯一比對(duì)的序列(Unique Mapped Reads)。第三部分，將bam文件進(jìn)行Peak檢測(cè)，得到富集區(qū)域的信息。通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)信息得到正負(fù)鏈間的鏈互相關(guān)系數(shù)(Strand Cross Correlation，SCC)以評(píng)估富集效果。鏈互相關(guān)系數(shù)通過最大交叉相關(guān)值除以背景交叉相關(guān)的比率(normalized strand cross-correlation coefficient,NSC)和片段長(zhǎng)度相關(guān)值減去背景相關(guān)值除以幻影峰(phantom-peak)相關(guān)值減去背景相關(guān)值的比率(relative strand cross-correlation coefficien,RSC)衡量。當(dāng)NSC顯著小于1.05時(shí)，表示數(shù)據(jù)傾向于具有低信噪比，或者最后得到的Peak數(shù)很少(這可能與樣本相關(guān)，如某些特定組織類型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合較少；也可能是測(cè)序質(zhì)量很差)。當(dāng)RSC顯著低于1時(shí)，實(shí)驗(yàn)往往具有低信噪比。RSC值較低可能是由于ChIP失敗和質(zhì)量差，測(cè)序reads質(zhì)量低并且大量錯(cuò)配，測(cè)序深度低(顯著低于飽和度)或這些原因共同導(dǎo)致。并進(jìn)行Peak在基因功能元件的分布，最近基因?qū)ふ?。第四部分，通過比對(duì)分析IP和input組的reads信息，得到質(zhì)量合格的有效read序列。得到比對(duì)到基因組的有效reads的信息，利用MACS分析軟件(version:2.1.1.20160309)在基因組范圍內(nèi)分析Peak信息。篩選顯著性的Peak的閾值為Qvalue<0.05。第五部分，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣本差異分析，統(tǒng)計(jì)差異Peak分布情況，從顯著性差異Peak結(jié)果，找到距離Peak的summit位置(無summit位置則取中點(diǎn)位置)最近的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因，即認(rèn)為此Peak與該基因具有相互關(guān)聯(lián)的特性。對(duì)這些基因進(jìn)行KEGG注釋，將KEGG注釋的map號(hào)對(duì)應(yīng)的gene進(jìn)行富集分析，按P<0.05篩選出顯著性富集的通路。

2 結(jié) 果

2.1 染色質(zhì)免疫共沉淀DNA制備效果 片斷化前DNA完整度較好，片斷化后DNA片段彌散范圍為100～2000bp，并且100～500bp之間的亮度最高，符合后續(xù)分析要求。見圖1。

圖1 各組樣品DNA完整性及片段化效果的瓊脂糖凝膠電泳圖1：KGN應(yīng)用溶劑處理組(KGN-NC，對(duì)照組)片段化前染色質(zhì)；2：KGN應(yīng)用溶劑處理組(KGN-NC，對(duì)照組)片段化后染色質(zhì)；3：KGN應(yīng)用10-5mol/L睪酮處理組(KGN-T，實(shí)驗(yàn)組)片段化前染色質(zhì)；4：KGN應(yīng)用10-5mol/L睪酮處理組(KGN-T，實(shí)驗(yàn)組)片段化后染色質(zhì)

2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)基本信息統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量評(píng)估 測(cè)序完成后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭序列、污染序列、低質(zhì)量堿基處理，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean reads)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得到數(shù)據(jù)基本信息(表1)。從Q20和Q30可以看出測(cè)序質(zhì)量可靠。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均對(duì)IP樣本和Input樣本同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，通過比對(duì)分析得到IP的有效reads。

表1 clean data數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

2.3 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對(duì)分析 將Clean reads數(shù)據(jù)使用BWA軟件(version:0.7.15-r1140)比對(duì)參考基因組(參考基因組版本：Hgl9)(表2)，其中比對(duì)到基因組上唯一位置的reads(唯一比對(duì)reads)將用于后續(xù)的信息分析(表2)。

表2 ChIP-Seq序列比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4 富集實(shí)驗(yàn)鏈互相關(guān)系數(shù)分析 通過鏈互相關(guān)系數(shù)評(píng)估富集效果。各組樣本的NSC和RSC值見表3，各組NSC值均大于1.05，RSC值均大于1.0，提示雄激素受體抗體成功富集了其結(jié)合的DNA片段。

表3 樣本鏈互相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計(jì)表

2.5 全基因組Peak掃描及分布分析 采用Peak交集的方式對(duì)兩個(gè)樣品即對(duì)照組和高濃度睪酮處理組進(jìn)行差異分析，確定組間上調(diào)及下調(diào)差異修飾的區(qū)間。高濃度睪酮處理后KGN細(xì)胞(KGN-T)中雄激素受體結(jié)合的Peak為1823個(gè)，對(duì)照組細(xì)胞(KGN-NC)中雄激素受體結(jié)合的Peak為2322個(gè)，兩組均存在結(jié)合的Peak數(shù)為11個(gè)。

Peak在整個(gè)基因組范圍內(nèi)的分布：基因間區(qū)占0.4872，基因內(nèi)含子區(qū)占0.4716，基因啟動(dòng)子區(qū)占0.0182，基因外顯子區(qū)占0.0172，基因3'UTR區(qū)占0.0057。Peak在基因內(nèi)的分布：基因內(nèi)含子區(qū)占0.9197，基因啟動(dòng)子區(qū)占0.0356，基因外顯子區(qū)占0.0335，基因3'UTR區(qū)占0.0112?？梢姶蟛糠址寮杏诨蜷g區(qū)與內(nèi)含子。

2.6 高雄激素效應(yīng)Peak關(guān)聯(lián)基因KEGG通路富集分析 高雄激素誘導(dǎo)雄激素受體結(jié)合的Peak關(guān)聯(lián)靶基因分別富集到凋亡、鐵死亡、細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)、磷脂酶D信號(hào)途徑、cAMP信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用8個(gè)通路上，共涉及基因43個(gè)。富集通路及相關(guān)基因信息,見表4。

表4 高雄激素誘導(dǎo)其受體結(jié)合Peak關(guān)聯(lián)靶基因KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討 論

臨床調(diào)查顯示，60%～80%的PCOS患者出現(xiàn)血循環(huán)中高水平的睪酮，25%的患者出現(xiàn)血循環(huán)中高水平的DHEA[5]。這些數(shù)據(jù)均提示高雄激素可能是PCOS致病的根本因素。在動(dòng)物模型中已證實(shí)，胎兒時(shí)期雄激素暴露會(huì)導(dǎo)致PCOS，但具體分子機(jī)制尚不清楚。

雄激素功能的發(fā)揮依賴于與雄激素受體結(jié)合。雄激素受體是一種轉(zhuǎn)錄因子，能識(shí)別靶因子上專一的DNA序列并與之結(jié)合，從而調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄。在全基因組水平將轉(zhuǎn)錄因子定位于靶基因DNA是認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有效方法。染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合高通量基因測(cè)序技術(shù)(ChIP-Seq)是研究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、組蛋白特異性修飾位點(diǎn)、核小體定位及DNA甲基化等蛋白質(zhì)與DNA相互作用的表觀遺傳學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)之一。與ChIP-芯片相比，ChIP-Seq技術(shù)需要更少的標(biāo)本量即可實(shí)現(xiàn)更高水平的單堿基對(duì)分辨率，同時(shí)具備更少的假陽性信號(hào)干擾和更好的覆蓋范圍和更大的動(dòng)態(tài)范圍，產(chǎn)生更精確的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)列表，以及轉(zhuǎn)錄因子、增強(qiáng)子和序列基序的鑒定[6-7]。本研究以卵巢內(nèi)分泌原理的兩細(xì)胞理論學(xué)說為基礎(chǔ)，選擇卵泡顆粒細(xì)胞系為研究對(duì)象，首次應(yīng)用ChIP-seq技術(shù)對(duì)高雄激素狀態(tài)下導(dǎo)致的AR所介導(dǎo)的全基因組范圍內(nèi)基因表達(dá)及信號(hào)通路的改變進(jìn)行系統(tǒng)分析，尋找顆粒細(xì)胞系中的關(guān)鍵AR靶基因?qū)α私釶COS發(fā)生有著重要意義。結(jié)果表明，與未用睪酮處理組相比，高雄激素誘導(dǎo)雄激素受體結(jié)合的Peak關(guān)聯(lián)靶基因富集到細(xì)胞凋亡、鐵死亡、CAMs、磷脂酶D信號(hào)途徑、cAMP信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝、神經(jīng)活性配體-受體相互作用8個(gè)信號(hào)通路上，共涉及基因43個(gè)。

高雄激素誘導(dǎo)雄激素受體結(jié)合的Peak關(guān)聯(lián)靶基因富集到細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。這與以往研究相符，已有多項(xiàng)研究認(rèn)為PCOS卵泡發(fā)育障礙可能與高雄激素血癥作用下顆粒細(xì)胞凋亡異常有關(guān)[3-4]。Ding等[3]對(duì)77例PCOS患者和67例健康人的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PCOS患者中凋亡相關(guān)基因PDCD4表達(dá)顯著增加，卵巢顆粒細(xì)胞凋亡水平增加，而體外敲除PDCD4基因后能改善其凋亡水平。此外，本課題組前期研究結(jié)果表明，高濃度睪酮通過降低PDCD4啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞PDCD4表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)其凋亡[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，高雄激素誘導(dǎo)其受體結(jié)合基因富集到鐵死亡信號(hào)通路。鐵死亡是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡類型，是一種鐵依賴性的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式，由過度的脂質(zhì)過氧化所引起，與各種類型腫瘤的發(fā)生和治療反應(yīng)有關(guān)。目前鐵死亡在PCOS中的作用研究較少，母體高雄激素血癥和胰島素抵抗導(dǎo)致大鼠妊娠子宮和胎盤鐵死亡的激活[8]。高雄激素對(duì)顆粒細(xì)胞鐵死亡的影響，尚未見研究報(bào)道。

高雄激素誘導(dǎo)雄激素受體結(jié)合的Peak關(guān)聯(lián)靶基因富集到的磷脂酶D信號(hào)途徑、cAMP信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路多是涉及將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號(hào)，通過第二信使及蛋白激酶的激活，對(duì)其一系列靶蛋白進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，參與細(xì)胞的眾多功能改變。而神經(jīng)活性配體受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合。已有研究報(bào)道，PCOS的發(fā)病相關(guān)基因富集在神經(jīng)活性配體受體相互作用、cAMP信號(hào)通路等方面[9]。此外，通過整合DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析來鑒定與PCOS相關(guān)的潛在重要生物標(biāo)志物的研究也表明，PCOS與神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路具有相關(guān)性[10]。PCOS患者肌醇代謝異常[11]，可能存在肌醇轉(zhuǎn)化為D-手性肌醇的缺陷，這種缺陷將導(dǎo)致胰島素抵抗和高雄激素血癥的綜合征[12]。然而這些相關(guān)通路是否與高雄激素有關(guān)及其如何參與PCOS的發(fā)病機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

高雄激素誘導(dǎo)雄激素受體結(jié)合的43個(gè)Peak關(guān)聯(lián)靶基因中，已有研究報(bào)道CTLA4基因可能與PCOS相關(guān)，通過調(diào)節(jié)肥胖和HOMA-IR對(duì)PCOS產(chǎn)生影響[13]。F2R基因與PCOS具有相關(guān)性[14]。PIK3R1基因多態(tài)性與PCOS的主要表型無關(guān)[15]，循環(huán)ghrelin水平與PCOS的異常激素模式之間沒有關(guān)系[16]。脫氫表雄酮建立的大鼠PCOS模型中p-JNK表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組[17]，JNK抑制劑具有預(yù)防PCOS的作用[18]。其他基因與PCOS的關(guān)系尚未見研究報(bào)道。高雄激素是否誘導(dǎo)其受體與這些候選基因結(jié)合尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了高雄激素誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生改變的重要信號(hào)通路，研究結(jié)果有助于從源頭上揭示雄激素參與PCOS發(fā)病機(jī)理的機(jī)制，為PCOS的發(fā)病和遺傳學(xué)機(jī)制提供新的思路。雄激素通過其受體可能結(jié)合基因的闡明為后續(xù)更深入地研究PCOS的發(fā)病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。期待下一步的實(shí)驗(yàn)?zāi)芎Y選及鑒定出某些關(guān)鍵的雄激素受體直接作用的下游靶基因，為PCOS的治療提供新靶點(diǎn)。