范李靜，張 苗，鄭瑛紅，劉文杰，范小斌

(西北大學(xué)附屬醫(yī)院西安市第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710021)

宮腔粘連(intrauterine adhesions，IUAs)，也稱為Asherman綜合征，是一種子宮疾病，其特征是子宮內(nèi)膜受損，盆腔或?qū)m內(nèi)發(fā)生疤痕和粘連[1]。宮腔粘連是宮內(nèi)手術(shù)或子宮內(nèi)膜感染、產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎有關(guān)的并發(fā)癥[2]。宮腔粘連發(fā)生的主要原因是細(xì)胞外基質(zhì)生成和降解異常，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度的堆積導(dǎo)致子宮內(nèi)膜纖維化進(jìn)一步形成瘢痕發(fā)生宮腔粘連。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是一種較強(qiáng)的促纖維化因子，與創(chuàng)面的修復(fù)愈合有關(guān)，高表達(dá)的TGF-β1對(duì)纖維疤痕組織的形成有促進(jìn)作用。TGF-β1激活后，可與其受體結(jié)合并激活下游Smad信號(hào)，包括Smad2和Smad3，使其組織發(fā)生纖維化[3]。已有相關(guān)研究表明，TGF-β1/Smad信號(hào)通路參與宮內(nèi)粘連[3]。MicroRNAs(miRNAs)是一種小的、內(nèi)源性的、非編碼的、由18～22個(gè)核苷酸組成的單一RNA分子，通過(guò)直接結(jié)合其靶基因的3'-UTR調(diào)控基因表達(dá)[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs的失調(diào)參與了宮腔粘連。宮腔粘連小鼠的子宮內(nèi)膜中miR-1291水平顯著升高[5]。miR-34a-5p具有促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞增殖的能力[6]。miR-34a-5p在纖維化疾病肝硬化中表達(dá)降低，人肝星狀細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)miR-34a-5p通過(guò)靶向Smad4和調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3途徑可以改善肝纖維化的發(fā)展[7]。而miR-34a-5p在宮腔粘連纖維化疾病中的研究未見相關(guān)研究報(bào)道。基于此，本文擬研究miR-34a-5p在子宮內(nèi)膜纖維化中的作用，并探討其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2020年10月至2021年6月于西安市第三人民醫(yī)院婦產(chǎn)科行宮腔鏡檢查并確診為宮腔黏連的患者20例，年齡30～45歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)宮腔檢查符合宮腔粘連的診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并婦科惡性腫瘤、不典型增生；合并生殖道和泌尿道急性感染。選取同期行宮腔鏡檢查的非宮腔黏連患者20例(因子宮縱膈、不孕或節(jié)育器嵌頓)作為對(duì)照組，年齡21～35歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、儀器 人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(human endometrial stromal cell，hESC，CL0453)購(gòu)自湖南豐暉生物；psiCHECK-2質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Promega；胎牛血清、雙抗購(gòu)自Hyclone；MEM+NEAA培養(yǎng)基(PM150410)購(gòu)自武漢普諾賽；TGF-β1(10804-HNAC)購(gòu)自北京義翹神州；miR-34a-5p mimics和pcDNA3.1-Smad4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪基因；X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent(04476093001)、FastStart Essential DNA Green Master(06924204001)購(gòu)自美國(guó)Roche公司；psiCHECK-2-WT-Smad4、psiCHECK-2-MUT-Smad4質(zhì)粒合成于北京擎科生物；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1622)購(gòu)自美國(guó)Thermo；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體(ab5831)、膠原蛋白Ⅰ(collagen I，COL1A1)抗體(ab138492)、纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)抗體(ab45688)和Smad4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam；細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(C008-3)、Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(A005-3)購(gòu)自上海七海復(fù)泰。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 hESC細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo) hESC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(MEM+NEAA+1%雙抗)，5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hESC細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，按3×105細(xì)胞/孔鋪至6孔板。待細(xì)胞貼壁，更換成含5%血清的培養(yǎng)基，分別加5ng/mL和10ng/mL的TGF-β1處理細(xì)胞24h和48h，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

1.3.2 miR-34a-5p mimics轉(zhuǎn)染hESC細(xì)胞 將hESC細(xì)胞按5×104細(xì)胞/孔鋪至24孔板，待細(xì)胞匯合度為40%左右時(shí)每孔加50pmol/L miR-34a-5p mimics或mimics NC，經(jīng)X-treme GENE siRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染24h，檢測(cè)miR-34a-5p表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞分組：Control組：未處理的正常hESC細(xì)胞；TGF-β1組：10ng/mL TGF-β1處理hESC細(xì)胞；mimics NC組：hESC細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics NC后經(jīng)10ng/mL TGF-β1處理；miR-34a-5p mimics組：hESC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics后經(jīng)10ng/mL TGF-β1處理。

1.3.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 根據(jù)細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hESC細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并接種至96孔板。經(jīng)特定處理后，每孔加100 μL 7Sea-Cell Counting Kit溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450nm處的吸光值。

1.3.4 miR-34a-5p靶基因預(yù)測(cè) 利用miRanda、TargetScan及PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-34a-5p的潛在靶基因并取其交集。利用David網(wǎng)站對(duì)得到的188個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG通路分析，并篩選miR-34a-5p的靶基因。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 經(jīng)生物信息學(xué)分析，初步篩選Smad4為miR-34a-5p的靶基因；將包含miR-34a-5p結(jié)合序列的psiCHECK-2-Smad4野生質(zhì)粒(psiCHECK-2-Smad4-wt)及psiCHECK-2-Smad4突變質(zhì)粒(psiCHECK-2-Smad4-mut)分別與miR-34a-5p mimics和mimics NC用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染入人胚腎細(xì)胞HEK-293T。 48h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒檢測(cè)Smad4的熒光強(qiáng)度，驗(yàn)證miR-34a-5p和Smad4之間的靶向關(guān)系。

1.3.6 Smad4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 分離、純化并擴(kuò)增Smad4的基因片段，與pCDNA3.1連接(pCDNA3.1-Smad4)，空質(zhì)粒載體pCDNA3.1-vector作為陰性對(duì)照。將pCDNA3.1-Smad4和pCDNA3.1-vector用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染入hESC細(xì)胞，孵育48h后檢測(cè)Smad4表達(dá)以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。將miR-34a-5p mimics和Smad4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至hESC細(xì)胞，TGF-β1處理24h檢測(cè)hESC細(xì)胞的增殖情況和纖維化情況。

1.3.7 實(shí)時(shí)定量PCR hESC細(xì)胞和經(jīng)研磨處理的子宮內(nèi)膜組織經(jīng)TRizol裂解液裂解提取樣本的RNA。Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)。反應(yīng)條件：95℃，300s；95℃，5s，60℃，30s，循環(huán)次數(shù)為45次。

1.3.8 Western blot檢測(cè) 將收集的細(xì)胞加適量體積的RIPA裂解液并收集上清。BCA法測(cè)定總蛋白濃度。準(zhǔn)備好樣品，用微量進(jìn)樣器上樣，每孔上樣量20μg蛋白，使用恒壓80V電泳。電轉(zhuǎn)至PVDF膜(電流200mA轉(zhuǎn)膜2h)，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床孵育封閉1h。PVDF膜加入α-SMA、fibronectin和COL1A一抗， 4℃搖床過(guò)夜孵育。將膜置于二抗稀釋液，室溫?fù)u床孵育1h。加入ECL蛋白發(fā)光液觀察蛋白條帶，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-34a-5p在宮腔粘連內(nèi)膜組織及TGF-β1處理后hESC細(xì)胞中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與未粘連組[1.38(0.65，2.05)]相比，粘連組的miR-34a-5p表達(dá)水平[0.74(0.42，1.01)]顯著降低(Z=-2.218，P=0.027)。10ng/mL TGF-β1分別處理hESC細(xì)胞24、48h后，細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。后續(xù)均用10ng/mL TGF-β1處理hESC細(xì)胞24h。見圖1。

圖1 TGF-β1處理的hESC細(xì)胞中miR-34a-5p表達(dá)水平#P<0.01 vs control組

2.2 miR-34a-5p對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)hESC增殖和細(xì)胞形態(tài)的影響 CCK-8結(jié)果顯示，TGF-β1組hESC細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組[(114.1±0.94)% vs (100 ±0.76)%，P= 0.003]；與mimics NC組相比，miR-34a-5p mimics組細(xì)胞增殖顯著下降[(113.8±1.1)% vs (105.4± 0.5)%，P=0.001]。Control組細(xì)胞形態(tài)呈圓形或卵圓形，胞間連接緊密。TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間隙較大。miR-34a-5p mimics組細(xì)胞形態(tài)與Control組相似，多為圓形或卵圓形(圖2)。

圖2 miR-34a-5p對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的hESC細(xì)胞形態(tài)的影響A:Control;B:TGF-β1;C:TGF-β1+mimics NC;D:TGF-β1+ miR-34a-5p mimics

2.3 miR-34a-5p對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)hESC纖維化的影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，TGF-β1組纖維化標(biāo)志物α-SMA、fibronectin和COL1A1顯著升高(P<0.05)，miR-34a-5p mimics組的α-SMA、fibronectin和COL1A1表達(dá)顯著低于mimics NC組(P<0.05)。見圖3。提示miR-34a-5p對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的hESC纖維化有抑制作用。

圖3 miR-34a-5p對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)hESC纖維化的影響A～C:qRT-PCR檢測(cè)hESC細(xì)胞中α-SMA、fibronectin和COL1A1的mRNA的表達(dá)水平； D～G:Western blot法檢測(cè)hESC細(xì)胞中α-SMA、fibronectin和COL1A1蛋白表達(dá)水平;*P<0.05;1:control;2:TGF-β1;3:TGF-β1+NC;4:TGF-β1+miR-34a-5p mimics

2.4 Smad4是miR-34a-5p的靶基因 David網(wǎng)站分析顯示，miR-34a-5p的靶基因主要分布于TGF-β 通路，這些靶基因主要包括Smad4、p70S6k等。Smad4作為TGF-β的激活分子是miR-34a-5p的一個(gè)靶基因(圖4A)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組比較，miR-34a-5p可顯著抑制Smad4 3'-UTR野生型的報(bào)告基因活性，而對(duì)Smad4 3'-UTR突變型的報(bào)告基因活性沒有影響(圖4A)。表明miR-34a-5p可作用于Smad4的3'-UTR區(qū)。Western blot結(jié)果表明，miR-34a-5p過(guò)表達(dá)可顯著下調(diào)Smad4蛋白的表達(dá)水平(圖4B)。

圖4 Smad4是miR-34a-5p的靶基因A：雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒hESC細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度；B：Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-34a-5p后Smad4表達(dá)水平；*P<0.05

2.5 Smad4參與miR-34a-5p的抗增殖、抗纖維化作用 與空載體對(duì)照處理的hESC相比，Smad4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hESC細(xì)胞后Smad4表達(dá)水平升高2.3倍(P=0.004)。見圖5A、B。過(guò)表達(dá)Smad4后，hESC細(xì)胞活力顯著升高(圖5C)。與共轉(zhuǎn)染miR-34a-5p和空載對(duì)照的hESC細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染miR-34a-5p和Smad4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的hESC細(xì)胞內(nèi)α-SMA(P=0.01)和COL1A1(P<0.01)mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(圖5D～H)。

圖5 Smad4參與miR-34a-5p對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)hESC細(xì)胞增殖和纖維化作用的抑制A、B：Smad4過(guò)表達(dá)效率檢測(cè)；C：CCK-8檢測(cè)各組hESC細(xì)胞活力；D、E:qRT-PCR檢測(cè)各組hESC細(xì)胞α-SMA和COL1A1 mRNA表達(dá)量；F:Western blot法檢測(cè)hESC細(xì)胞中α-SMA和COL1A1蛋白表達(dá)水平；G、H:hESC細(xì)胞中α-SMA和COL1A1蛋白相對(duì)定量水平。*P<0.05；#P<0.05;1:miR-34a-5p mimics;2:miR-34a-5p mimics+Scramble;3:miR-34a-5p mimics+Smad4

3 討 論

宮腔粘連是育齡婦女最常見的疾病之一，中度至重度宮腔粘連患者正常月經(jīng)模式減少、閉經(jīng)甚至不孕，對(duì)患者的身心健康產(chǎn)生不利影響。TGF-β在宮腔粘連的形成中起重要作用，宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜中TGF-β蛋白水平顯著升高，促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)生纖維化[8]。

miRNAs在纖維化的調(diào)節(jié)中起著決定性的作用。miR-326在宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中下調(diào)，miR-326通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路抑制子宮內(nèi)膜纖維化[9]。miR-543通過(guò)抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制宮腔粘連的發(fā)生和發(fā)展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮腔粘連內(nèi)膜組織中miR-34a-5p表達(dá)量降低。miR-34家族具有強(qiáng)大的促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞增殖的作用[6]。miR-34a-5p參與腎小管間質(zhì)纖維化及肝臟纖維化等多種纖維化疾病[7,11]。目前miR-34a-5p是否影響宮腔粘連纖維化還未見研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p參與hESC細(xì)胞的纖維化，miR-34a-5p表達(dá)增加可降低hESC細(xì)胞的纖維化進(jìn)程。這與Zhang等[12]研究結(jié)果相似，即miR-34a可通過(guò)減少I型膠原蛋白的產(chǎn)生以及通過(guò)靶向Pin-1信號(hào)傳導(dǎo)減輕糖尿病性心肌病的心肌纖維化。但也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a促進(jìn)肝星狀細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞纖維化[13-14]。上述結(jié)果的差異可能與細(xì)胞及疾病種類相關(guān)。

Smad4表達(dá)失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，如組織纖維化、炎癥和癌變，提示Smad4在治療這些疾病方面具有治療潛力[15]。本研究利用miRanda、TargetScan、Pictar數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了miR-34a-5p的潛在靶基因，預(yù)測(cè)Smad4的3'UTR區(qū)和miR-34a-5p可能有結(jié)合位點(diǎn)；使用雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證確定Smad4的3'UTR區(qū)和miR-34a-5p有結(jié)合。本研究結(jié)果顯示，Smad4表達(dá)水平影響纖維化，hESC細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimics和Smad4后，過(guò)表達(dá)Smad4可逆轉(zhuǎn)miR-34a-5p mimics抗纖維化作用。表明Smad4與miR-34a-5p共同影響TGF-β1介導(dǎo)的hESC細(xì)胞纖維化進(jìn)程，參與miR-34a-5p的抗增殖抗纖維化作用。

綜上所述，宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中miR-34a-5p表達(dá)量降低；miR-34a-5p可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的hESC細(xì)胞的增殖和纖維化；miR-34a-5p及其靶基因Smad4共同調(diào)控hESC細(xì)胞的增殖和纖維化，有望成為宮頸粘連的新治療靶點(diǎn)。