文小玲,陳思盼,田 甜,于 嘯,婁艷輝*

(1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，青島 266003；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院,武漢市婦幼保健院，武漢 430000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)惡性程度高，侵襲性強，進(jìn)展迅速，70%以上患者就診時已出現(xiàn)盆腹腔內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)移及惡性腹水。目前卵巢癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制尚未闡明[1]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是一群具有自我更新及多向分化潛能的增殖細(xì)胞群體，是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要原因之一[2-3]。因此，尋找并明確卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(ovarian cancer stem-like cell,OCS-LC)轉(zhuǎn)化過程中的重要作用基因，進(jìn)而闡明卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機制，對卵巢癌的臨床治療具有重要意義。目前關(guān)于長鏈非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA,LncRNA)在OCS-LC中作用的研究報道較少?；蜷g長鏈非編碼RNA-重編碼調(diào)控因子ROR(Linc-ROR)是Lnc RNA的一種，因其能上調(diào)細(xì)胞中核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4和Nanog蛋白表達(dá)，在維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多分化潛能中發(fā)揮重要作用[4-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Linc-ROR與CSCs的干性表型和功能調(diào)控密切相關(guān)[6]，但在OCS-LC中的作用尚未被研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Linc-ROR在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)，并且能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，與卵巢癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本研究通過研究Linc-ROR在OCS-LC干性調(diào)控及功能維持中的重要作用，旨在探討Linc-ROR是否通過增強OCS-LC干性特征進(jìn)而促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料來源 高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；含牛血清白蛋白(BSA)和胰島素購自美國Sigma公司；表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(recombinant human fibroblast growth factor，bFGF)購自美國Peprotech公司；慢病毒載體構(gòu)建于上海吉凱基因；鼠抗人CD133(抗CD133-APC)流式抗體及同型鼠IgG抗體購自美國Biolegend公司；Trizol試劑、Script RT Reagent Kit試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。A2780細(xì)胞在含10%胎牛血清、10g/L青鏈霉素(100kU/L青霉素和0.1g/L鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 OCS-LC的誘導(dǎo)及鑒定

1.3.1.1 OCS-LC誘導(dǎo) 將A2780細(xì)胞消化離心,重懸于以DMEM/F12(1∶1)為基礎(chǔ)，含0.4% BSA、0.02g/L EGF、0.01g/L bFGF、5g/L胰島素的無血清培養(yǎng)基中，按2000細(xì)胞/孔接種于超低吸附6孔板，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。

1.3.1.2 OCS-LC的鑒定 (1)成球?qū)嶒灒捍T導(dǎo)成球后，收集上述誘導(dǎo)所得直徑大于70μm的干細(xì)胞球，消化離心，用無血清培養(yǎng)基重懸，重新接種于超低吸附6孔板中培養(yǎng)7～10d，觀察可否二次成球。(2)分化實驗：收集胰酶消化后的OCS-LC單細(xì)胞懸液，重新置于含血清的培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，不同時間段觀察細(xì)胞能否分化為貼壁狀態(tài)。(3)流式分析技術(shù)分析OCS-LC的CD133+細(xì)胞陽性率：分別收集對數(shù)生長期的A2780貼壁細(xì)胞和誘導(dǎo)所得的OCS-LC，胰酶消化，加含血清的培養(yǎng)基終止消化，1000r/min離心5min，棄上清，PBS洗滌2次，重懸于4℃預(yù)冷PBS(2% BSA)中，調(diào)整細(xì)胞濃度1×109細(xì)胞/mL。兩組細(xì)胞各取100μL細(xì)胞溶液，加1μg抗CD133-APC抗體，IgG為同型對照；4℃避光孵育30min，重懸于100μL PBS中，2h內(nèi)在BD FACS Aria流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

1.3.2 雙熒光素酶實驗驗證Linc-ROR RNA與miR-181c-5p RNA結(jié)合情況 生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測Linc-ROR RNA與miR-181c-5p的靶向結(jié)合位點，分別構(gòu)建Linc-ROR野生型和突變型(Linc-ROR-WT/MUT)報告基因質(zhì)粒，將報告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至過表達(dá)miR-181c-5p RNA(miR-181c-5p mimics)的A2780卵巢癌細(xì)胞中。48h后，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Promega,Madison,WI,USA)測定細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

1.3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染 構(gòu)建Linc-ROR小分子干擾RNA(Linc-ROR siRNA)和陰性對照Linc-ROR siRNA(Linc-ROR siRNA-NC)，通過慢病毒感染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染Linc-ROR siRNA和Linc-ROR siRNA-NC至A2780細(xì)胞。按摸索條件MOI=10，對慢病毒液冰上溶解并稀釋后感染細(xì)胞，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)基，并篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株用于后續(xù)實驗。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

1.3.4 OCS-LC成球能力的評估 采用與1.3.1.1相同方法，分別將si-ROR A2780細(xì)胞和control-ROR A2780細(xì)胞誘導(dǎo)生成si-OCS-LC和control-OCS-LC。顯微鏡下拍照記錄各組成球情況，通過成球率、成球周期及最大球直徑來評估各組OCS-LC成球能力。OCS-LC成球率=直徑超過70μm的細(xì)胞球數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

1.3.5 免疫熒光染色檢測OCS-LC中CD133+細(xì)胞率 收集si-OCS-LC和control-OCS-LC細(xì)胞球，制備成細(xì)胞玻片，4%冰凍多聚甲醛固定，0.1% TritonX-100室溫下打孔，PBS洗滌3次，5% BSA室溫封閉30min，加一抗CD133(1∶300)4℃過夜避光孵育，加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶500)，37℃避光孵育1h，PBS洗滌3次，DAPI染色。激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1200,Japan)下觀察、照相。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

1.3.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測各組OCS-LC中Linc-ROR、miR-181c-5p及核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog mRNA表達(dá) 采用RT-qPCR技術(shù)檢測誘導(dǎo)生成的OCS-LC中Linc-ROR mRNA較誘導(dǎo)前A2780貼壁細(xì)胞的表達(dá)差異，si-OCS-LC和control-OCS-LC細(xì)胞球中核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog mRNA表達(dá)水平，以及Linc-ROR RNA、miR-181c-5p RNA的變化情況。用Trizol試劑分別提取各組細(xì)胞中總RNA，用Prime Script RT Reagent Kit試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴增。所涉及引物序列見表1。以U6為miR-181c-5p RNA的內(nèi)參照，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為其他基因的內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法計算Linc-ROR、miR-181c-5p、Oct-4和Nanog mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，實驗結(jié)果取均值。

表1 RT-qPCR所用引物序列

1.3.7 Western blot實驗檢測Oct-4、Nanog蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，用PBS洗滌，并在含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液中裂解。按試劑盒說明書配好SDS-聚丙烯酰胺凝膠，SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2h。一抗4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體(1∶15000)室溫孵育2h,化學(xué)發(fā)光增強劑(ECL)進(jìn)行顯色。一抗：兔源單克隆抗GAPDH(1∶1000)、兔源單克隆抗Oct-4(1∶1000)、兔源單克隆抗Nanog(1∶1000)。

1.3.8 CCK-8實驗檢測細(xì)胞增殖能力 收集兩組細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度1×104細(xì)胞/mL,按1000細(xì)胞/孔分別接種于96孔板，培養(yǎng)24、48、72、96h后，每孔加10μL的CCK-8試劑，37℃避光孵育2h,于酶標(biāo)儀450nm波長下檢測吸光度OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.9 Transwell小室實驗檢測細(xì)胞的遷移、侵襲能力 細(xì)胞遷移實驗:將200μL的control-OCS-LC和si-OCS-LC無血清細(xì)胞懸液分別接種于Transwell小室上室，下室加600μL含30%FBS的DMEM培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h，取出小室，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，漂洗干燥。倒置顯微鏡下隨機選取3個視野，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，取平均值。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞侵襲實驗:Transwell小室上室需提前涂好人工基質(zhì)膠matrigel，37℃培養(yǎng)箱自然風(fēng)干，其余操作同細(xì)胞遷移實驗。評估兩組OCS-LC的遷移、侵襲能力。

2 結(jié) 果

2.1 OCS-LC誘導(dǎo)、鑒定結(jié)果 部分A2780細(xì)胞呈圓形懸浮于培養(yǎng)液，2～3d后逐漸形成松散的串珠樣結(jié)構(gòu)，4～7d后形成較規(guī)則的細(xì)胞球，7～10d后細(xì)胞球持續(xù)擴大，形態(tài)更加致密規(guī)則。細(xì)胞成球?qū)嶒烇@示，干細(xì)胞樣細(xì)胞懸液在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)時，能聚集成球克隆生長。分化實驗中，將細(xì)胞球重懸于含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，可重新分化成貼壁樣生長的卵巢癌細(xì)胞。流式分析結(jié)果顯示，OCS-LC和A2780貼壁細(xì)胞的CD133+比率分別為(18.00±0.30)%和(0.92±0.32)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示，OCS-LC的Linc-ROR mRNA相對表達(dá)量顯著高于A2780貼壁細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=34.02，P<0.001)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞分析技術(shù)分析A2780貼壁細(xì)胞和OCS-LC的CD133+比率A:OCS-LC細(xì)胞可呈球克隆生長(×100)；B:OCS-LC在特定培養(yǎng)條件下，可再次定向分化成貼壁樣生長的卵巢癌細(xì)胞(×40)；C:RT-qPCR顯示OCS-LC的Linc-ROR mRNA相對表達(dá)量顯著升高(***P<0.001)

2.2 雙熒光素酶報告實驗分析 通過生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測到Linc-ROR RNA和miR-181c-5p RNA存在靶向結(jié)合位點。見圖2。雙熒光素酶實驗靶向性驗證報告顯示，過表達(dá)miR-181c-5p RNA明顯降低Linc-ROR WT的熒光素酶活性，miR-181c-5p mimics+Linc-ROR WT組A2780細(xì)胞的熒光素酶活性(0.56±0.08)，低于NC mimics+Linc-ROR WT組(1.01±0.03)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.316，P<0.01)；結(jié)合位點突變序列的Linc-ROR MUT報告基因的熒光素酶活性不變,miR-181c-5p mimics+Linc-ROR MUT組A2780細(xì)胞的熒光素酶活性為(0.94±0.05)，與NC mimics+Linc-ROR MUT組比較(0.98±0.03)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Linc-ROR與miR-181c-5p結(jié)合位點的預(yù)測

2.3 Linc-ROR RNA對OCS-LC成球能力的影響 轉(zhuǎn)染后的成球?qū)嶒烇@示，兩組OCS-LC均能繼續(xù)成球生長，si-OCS-LC組和control-OCS-LC組的成球周期分別為(17±1)d、(11±1.5)d；最大球直徑分別為(78.6±4.0)μm、(108.0±2.0)μm；成球率分別為(0.53±0.1)%、(1.08±0.15)%。si-OCS-LC組和control-OCS-LC組相比，成球周期延長，最大球直徑變小，成球率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 Linc-ROR RNA對OCS-LC CD133+細(xì)胞率的影響 免疫熒光顯示，si-OCS-LC和control-OCS-LC分別經(jīng)FITC-CD133免疫熒光染色后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到細(xì)胞有明顯的綠色熒光，為CD133陽性，其中si-OCS-LC組CD133顯色細(xì)胞數(shù)更少,即CD133+細(xì)胞率較低。見圖3。

圖3 激光共聚顯微鏡下OCS-LC的CD133+比率A、B：分別為control-OCS-LC組的CD133+細(xì)胞與DAPI染核情況；C：圖A、B合成圖；D、E：分別為si-OCS-LC組的CD133+細(xì)胞與DAPI染核情況；F：圖D、E合成圖

2.5 Linc-ROR RNA對OCS-LC中miR-181c-5p及核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog表達(dá)的影響 實時熒光定量PCR結(jié)果表明，沉默Linc-ROR后，OCS-LC中核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog mRNA表達(dá)水平下降，miR-181c-5p mRNA表達(dá)水平則升高。Western blot結(jié)果顯示，沉默Linc-ROR RNA后，OCS-LC中核心轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog蛋白表達(dá)水平下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖4。

圖4 Linc-ROR對OCS-LC中miR-181c-5p、Oct-4及Nanog表達(dá)的影響A:RT-qPCR檢測mRNA相對表達(dá)量；B、C：Western blot檢測Oct-4、Nanog蛋白表達(dá)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.6 敲降Linc-ROR抑制OCS-LC的增殖、遷移、侵襲能力 敲降Linc-ROR后，si-OCS-LC的增殖能力顯著被抑制(P<0.05)。Transwell實驗顯示，si-OCS-LC組較control-OCS-LC組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，遷移、侵襲能力顯著被抑制(P<0.001)，見圖5。

圖5 敲降Linc-ROR后2組OCS-LC的增殖、遷移、侵襲能力比較A：control-OCS-LC和si-OCS-LC的增殖能力比較(*P<0.05)；B：control-OCS-LC和si-OCS-LC遷移細(xì)胞數(shù)比較(***P<0.001)； C：control-OCS-LC和si-OCS-LC侵襲細(xì)胞數(shù)比較(***P<0.001)

3 討 論

上皮性卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤，70%以上的晚期卵巢癌患者會在2～3年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥，5年生存率僅為43%[8]。目前，卵巢癌治療后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和化療耐藥仍是改善患者預(yù)后的重要挑戰(zhàn)。卵巢癌干細(xì)胞(ovarian cancer stem cells,OCSCs)是卵巢腫瘤組織或腫瘤微環(huán)境中的一類具有自我更新特性、多向分化潛能以及高致瘤性的細(xì)胞亞群，常以聚集的球體結(jié)構(gòu)存在，在卵巢癌惡性腹水中富含該類細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤惡性生長、耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要驅(qū)動因素，是腫瘤形成的根源[3,9]。因此，明確OCSCs的轉(zhuǎn)化及其功能的調(diào)控機制對卵巢癌的臨床治療具有重要意義。

Linc-ROR是近年新發(fā)現(xiàn)的一種基因間Lnc RNA，可作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)調(diào)控干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，在維持胚胎干細(xì)胞自我更新和多分化潛能中發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),Linc-ROR RNA在多種腫瘤中過高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌Linc RNA作用[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Linc-ROR RNA在Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于早期患者，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。進(jìn)一步的功能學(xué)實驗證實，沉默Linc-ROR RNA可抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。因此，卵巢癌組織中Linc-ROR RNA表達(dá)升高可能促進(jìn)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，然而相關(guān)分子調(diào)控機制目前尚未闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)，Linc-ROR RNA與CSCs的干性表型和功能調(diào)控密切相關(guān)[13]，但其與OCSCs的相關(guān)研究尚未見相關(guān)報道。本研究成功誘導(dǎo)生成OCS-LC，其Linc-ROR mRNA水平明顯高于誘導(dǎo)前A2780細(xì)胞，提示Linc-ROR RNA可能在OCS-LC轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用?；诖?，進(jìn)一步通過構(gòu)建低表達(dá)Linc-ROR RNA的細(xì)胞株并誘導(dǎo)生成OCS-LC，與A2780貼壁細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)成球周期延長，最大球直徑減小，且成球率降低，且干細(xì)胞標(biāo)志物CD133+細(xì)胞率下降。此外，低表達(dá)Linc-ROR RNA可下調(diào)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog mRNA表達(dá)。實驗結(jié)果表明，抑制Linc-ROR RNA可通過下調(diào)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog mRNA而減弱OCS-LC的干性特征，Linc-ROR RNA在OCS-LC的干性調(diào)控和維持中發(fā)揮重要作用。

在LncRNA的調(diào)控模式中，可競爭性結(jié)合和吸附一些特定的微小RNA(miRNA)，從而調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，共同形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[14]。研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌及胰腺癌等組織中，Linc-ROR RNA作為“分子海綿”干擾miR-145的功能，進(jìn)而調(diào)控靶基因Oct-4、Sox2和Nanog表達(dá)，促進(jìn)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移進(jìn)程[10,15-16]。為進(jìn)一步探究Linc-ROR RNA調(diào)控OCS-LC干性的分子機制，本研究通過生物信息學(xué)網(wǎng)站Segal Lab(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Linc-ROR RNA和miR-181c-5p RNA之間存在靶向結(jié)合位點，雙熒光素酶報告分析也驗證了二者具有靶向性，miR-181c-5p可能是Linc-ROR的下游靶基因。miR-181c-5p是微小RNA-181家族的重要成員之一，能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[17]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c RNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，過表達(dá)能負(fù)性調(diào)控EMT，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，是患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)，且抑制干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Nanog表達(dá)，可抑制腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞特性[18]。本研究中，抑制細(xì)胞Linc-ROR RNA表達(dá)后，誘導(dǎo)生成的OCS-LC中miR-181c-5p mRNA表達(dá)水平明顯升高，OCS-LC的成球周期延長，成球率降低，細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力下降，而且干細(xì)胞標(biāo)志物CD133+細(xì)胞率、Oct-4和Nanog表達(dá)降低。以上研究表明，Linc-ROR RNA通過負(fù)向調(diào)控miR-181c-5p表達(dá)和功能，進(jìn)一步干擾下游靶基因Oct-4和Nanog的表達(dá)從而調(diào)控OCS-LC干性，可能在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，但具體調(diào)節(jié)機制尚有待進(jìn)一步深入探討和驗證。

本研究對Linc-ROR/miR-181c-5p調(diào)控軸在卵巢癌干性特征及功能調(diào)控中的作用進(jìn)行了初步探討，對OCS-LC干性調(diào)控分子機制提供了新的認(rèn)識，為進(jìn)一步探討卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移機制提供新的研究靶點和實驗基礎(chǔ)。