羅玉馨，胡曉佳，曹竟尹，嚴(yán)成俊

(西安培華學(xué)院，西安 710125)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)以長(zhǎng)期氣流受限為主，其氣流受限多呈進(jìn)行性發(fā)展，預(yù)防和根治比較困難。COPD的產(chǎn)生原因主要是人體氣道和肺部產(chǎn)生炎癥或有毒氣體進(jìn)入肺部，最終導(dǎo)致COPD。其主要癥狀表現(xiàn)為患者出現(xiàn)慢性支氣管炎或肺氣腫[1-2]。這是一種可以使人喪失勞動(dòng)能力甚至喪失生活自理能力的嚴(yán)重疾病。近年來(lái)，COPD的患病率和病死率在世界各國(guó)仍居高不下。預(yù)計(jì)10年后，COPD將成為全球三大死因之一[3-5]。COPD的長(zhǎng)期治療將給患者和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]，故對(duì)其進(jìn)行深入的研究具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)研究能否順利開(kāi)展的主要前提是動(dòng)物模型的成功建立，并深入研究和分析動(dòng)物發(fā)生COPD的原因和規(guī)律，為治療和預(yù)防COPD提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選取

構(gòu)建COPD動(dòng)物模型的動(dòng)物種類(lèi)主要是嚙齒類(lèi)動(dòng)物，如豚鼠、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、斑點(diǎn)鼠等。而哺乳動(dòng)物主要是兔、犬、羊、豬、猴等。其中，最常用的是小鼠和大鼠，但大鼠多作為發(fā)現(xiàn)病理機(jī)制的參考。

1.1 豚鼠

豚鼠嗅覺(jué)較靈敏，對(duì)各種刺激均會(huì)作出極敏感的反應(yīng)，故在渾濁空氣中患肺炎的概率較高。此外，豚鼠的解剖特征與生理特征和人類(lèi)高度相似，其主要表現(xiàn)為肺部呈左二右三的肺葉結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有二分叉細(xì)支結(jié)構(gòu)。動(dòng)物的變態(tài)反應(yīng)與人類(lèi)的炎癥反應(yīng)基本相似，由于豚鼠肺損傷主要特征體現(xiàn)在軸突反射，而人類(lèi)的肺損傷軸突反射情況并不顯著，加上豚鼠價(jià)格非常高，無(wú)法獲得更多的能夠供血給藥的豚鼠尾巴，所以豚鼠做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的機(jī)會(huì)較低。

1.2 小鼠

小鼠體型較小，好飼養(yǎng)，繁殖時(shí)間短且繁殖后代多，可以在有限的空間進(jìn)行大規(guī)模的養(yǎng)殖，十分有利于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)造模。此外，小鼠基因結(jié)構(gòu)較清楚，與人類(lèi)在基因水平上高度同源。基因草圖顯示，DNA鏈上的基因與基因之間的片段十分相似，兩物種基因?qū)俣荚?萬(wàn)個(gè)左右。在進(jìn)行小組實(shí)驗(yàn)改造時(shí)，可采用易制備基因。對(duì)近交系小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，可直接排除掉遺傳變異的影響。按照本次實(shí)驗(yàn)的目的要求，可以適當(dāng)選擇一些敏感性較高品類(lèi)的小鼠，或者選擇一些體內(nèi)含有豐富酶及抗體的品類(lèi)小鼠，這有助于實(shí)驗(yàn)中開(kāi)展抗原鑒定測(cè)驗(yàn)、免疫印跡測(cè)驗(yàn)、胞流式測(cè)驗(yàn)等其他檢測(cè)。有關(guān)文獻(xiàn)證明，不同品種的小鼠對(duì)煙霧的敏感性不同。Limjunyawong等[7]發(fā)現(xiàn)，BALB/cJ小鼠相對(duì)于C57BL/6J小鼠，對(duì)外源性蛋白酶刺激有更強(qiáng)的敏感性[8]。

1.3 大鼠

大鼠用作動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)類(lèi)似于小鼠。大鼠與小鼠相比較，大鼠的體積大，方便靜脈注射及進(jìn)行肺組織和肺泡標(biāo)本的采集。但大鼠肺部缺少支氣管黏膜下腺體，此特征與人體肺部結(jié)構(gòu)不同，所以大鼠僅可作為發(fā)現(xiàn)病理機(jī)制的參考。

1.4 其他鼠類(lèi)

倉(cāng)鼠、斑點(diǎn)鼠和金黃地鼠等品系的鼠種也能用于COPD模型[9]的構(gòu)建，但實(shí)驗(yàn)試劑相對(duì)較少，動(dòng)物價(jià)格較高，且易受到遺傳變異等因素的影響，實(shí)驗(yàn)條件苛刻，不利于實(shí)驗(yàn)的順利展開(kāi)[6]，所以不作為造模動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的首選動(dòng)物。

1.5 其他動(dòng)物

兔、犬、猴、羊、豬等動(dòng)物雖與人類(lèi)肺部結(jié)構(gòu)高度相似，但價(jià)格高，難飼養(yǎng)，顯然在數(shù)量巨大的造模動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并不適用。使雪貂的鼻子暴露在香煙煙霧(CS)下6個(gè)月后，雪貂就出現(xiàn)了一系列明顯的細(xì)菌感染的病理特征。例如，在清晨的時(shí)候，雪貂就出現(xiàn)了伴有氣道阻塞的咳嗽(自發(fā)性咳嗽)、慢性黏液高分泌以及以氣道為中心的細(xì)菌感染。雪貂的這些表征與大鼠、小鼠相比較，更接近于人類(lèi)COPD的病理特征，但在檢測(cè)中卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯升高的組織阻尼，這個(gè)結(jié)果與人類(lèi)患COPD的特征有很大差異，所以還需要做進(jìn)一步研究[10]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選取應(yīng)滿(mǎn)足某些與人類(lèi)相似的特征和生理結(jié)構(gòu)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)人類(lèi)疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律進(jìn)行推測(cè)和探究，故本試驗(yàn)裝置系統(tǒng)選用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單又能直接反映研究指標(biāo)的動(dòng)物—小鼠。

2 構(gòu)建COPD的常用方法

在構(gòu)建COPD模型時(shí)，通常采用的方法包括煙草煙霧暴露法、基因改造法等，同時(shí)空氣污染物質(zhì)暴露法、多因素聯(lián)合誘導(dǎo)法也是構(gòu)建這種模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的常用方法。有研究認(rèn)為，吸煙為 COPD 最重要的誘導(dǎo)因素之一，所以通常情況下，在構(gòu)建這種模型時(shí)普遍會(huì)選擇煙草煙霧暴露法，以此達(dá)到較好的實(shí)驗(yàn)效果。

2.1 氣道內(nèi)蛋白酶滴注法

肺組織能維持正常的結(jié)構(gòu)主要是由于蛋白酶和抗蛋白酶兩個(gè)重要因素的平衡，以保證其免受破壞和損傷。若某一方增加或減少，均會(huì)引起失衡，導(dǎo)致肺組織損傷。以蛋白酶誘導(dǎo)模型作為單一的致病因素，常用豬胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等。給予小鼠鼻內(nèi)單次滴注蛋白酶，產(chǎn)生的肺氣腫現(xiàn)象基本符合COPD的主要特征，此法容易誘導(dǎo)明顯的肺氣腫，顯著地體現(xiàn)出異常的肺功能現(xiàn)象。

2.2 基因改造法

環(huán)境污染以及吸煙問(wèn)題導(dǎo)致人類(lèi)患有COPD的情況越發(fā)嚴(yán)重。辛亞男等[11]研究結(jié)果說(shuō)明吸煙是COPD重要誘導(dǎo)因素之一。但在吸煙人群中，并不是所有吸煙者都是患病者，個(gè)體易患因素應(yīng)得到研究者的重視。當(dāng)前，基因調(diào)控模型有很多類(lèi)型，如基因過(guò)度表達(dá)模型、常見(jiàn)的基因缺失COPD模型以及自然基因變異模型。李麗球等[12]研究表明，在小鼠體內(nèi)，抗氧化酶與抗蛋白酶對(duì)其身體所產(chǎn)生的破壞程度有著很大的差異，因此通過(guò)改變動(dòng)物的基因和COPD的發(fā)病機(jī)制，找出引發(fā)COPD的一些誘導(dǎo)原因，使實(shí)驗(yàn)者發(fā)現(xiàn)更好的治療辦法。

2.3 多因素聯(lián)合法

單因素誘導(dǎo)方法于實(shí)驗(yàn)中相對(duì)簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)且更易獲得可觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但COPD患者病因復(fù)雜，且COPD有較高的分級(jí)，單一的造模方法耗時(shí)長(zhǎng)，且難以同時(shí)模擬多種復(fù)雜的病理特征和生理病理改變情況，所以多因素聯(lián)合法更加省時(shí)省力，實(shí)驗(yàn)中可以更好的模擬COPD的典型特征以及病理生理改變情況，以達(dá)到更穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)效果。

2.4 腹腔注射法

在動(dòng)物腹腔內(nèi)注射煙草煙霧提取化合物或者注射異種內(nèi)皮細(xì)胞。香煙煙霧提取物(CSE)容易制備，價(jià)格低廉，操作較簡(jiǎn)單，而且建模時(shí)間短，可通過(guò)腹腔注射CSE來(lái)構(gòu)建COPD動(dòng)物模型。將自制的CSE溶液于相隔的天數(shù)中注入等量的劑量，經(jīng)過(guò)12周的實(shí)驗(yàn)期以后，實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)肺功能下降情況，大鼠在3周后即誘導(dǎo)出COPD模型，其原因主要是由于小鼠體內(nèi)肺泡腔不斷變大，肺泡破損，周?chē)募?xì)胞死亡數(shù)量也開(kāi)始增加，導(dǎo)致肺功能下降，符合COPD模型的建立。腹腔注射異種內(nèi)皮細(xì)胞建立COPD模型，由于建模時(shí)間短，沒(méi)有出現(xiàn)顯著的病理變化。COPD發(fā)病機(jī)制為異種內(nèi)皮細(xì)胞使機(jī)體在一段時(shí)間后產(chǎn)生抗體細(xì)胞并逐漸增多，人體內(nèi)的免疫功能開(kāi)始失衡，肺組織遭到破損，肺細(xì)胞死亡量開(kāi)始逐漸增加，最終導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。

2.5 脂多糖誘導(dǎo)法

在革蘭陰性菌細(xì)胞壁組成中，脂多糖是最主要的一種成分。脂多糖是一種內(nèi)毒素，可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及單核細(xì)胞等釋放炎性介質(zhì)，使其發(fā)生反應(yīng)，最終造成蛋白酶-抗蛋白酶失衡，嚴(yán)重?fù)p壞肺組織，導(dǎo)致肺氣腫。脂多糖的誘導(dǎo)模型常采用氣管內(nèi)滴注法，其建模時(shí)間較短，操作簡(jiǎn)便，可以模擬COPD機(jī)制的急性加重反應(yīng)，但不能模擬其慢性病變的過(guò)程，只能復(fù)制出COPD機(jī)制的部分病理特征，可與其他方法聯(lián)合使用[13]。

3 COPD試驗(yàn)系統(tǒng)裝置的研究與開(kāi)發(fā)

該裝置包括香煙煙霧的利用、整套工藝系統(tǒng)裝置的處理凈化(整套工藝系統(tǒng)外表面材料選用透明玻璃)。如圖1。

圖1 COPD試驗(yàn)系統(tǒng)裝置Fig.1 COPD test system device

3.1 香煙煙霧發(fā)生器

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為確保香煙煙霧均勻地?cái)U(kuò)散到活動(dòng)室頂部，通常情況下會(huì)將通風(fēng)口設(shè)置到活動(dòng)室下層的中間，這樣才可以確?；顒?dòng)室內(nèi)的香煙煙霧完全進(jìn)入動(dòng)物肺部，被動(dòng)物充分吸入，并保證動(dòng)物能夠在一個(gè)舒適的環(huán)境中生存。

3.2 動(dòng)物活動(dòng)室

上層為動(dòng)物活動(dòng)室、食物投放盒以及飲水投放盒三個(gè)格擋。每個(gè)格擋均可單獨(dú)打開(kāi)進(jìn)行試驗(yàn)操作、投放動(dòng)物、投放動(dòng)物食物、投放飲水等，操作靈活簡(jiǎn)單。在動(dòng)物活動(dòng)室當(dāng)中，實(shí)驗(yàn)員安裝了兩個(gè)溫濕度裝置，同時(shí)還安裝了一個(gè)監(jiān)控裝置，進(jìn)而方便實(shí)驗(yàn)員通過(guò)監(jiān)控設(shè)備觀察動(dòng)物在該場(chǎng)所中吸入CO的濃度、含氧量、溫度、濕度等關(guān)鍵參數(shù)。

3.3 香煙出口控制閥及通風(fēng)口

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以利用香煙出口控制閥或通風(fēng)口抽屜對(duì)動(dòng)物活動(dòng)室內(nèi)的環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)和控制。如可以控制和調(diào)節(jié)內(nèi)部環(huán)境CO的濃度參數(shù)，也可以調(diào)節(jié)環(huán)境內(nèi)含氧量參數(shù)等，使動(dòng)物的生存環(huán)境能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

3.4 凈化罐

試驗(yàn)裝置尾部?jī)艋薨艧煿艿?、控制閥、風(fēng)機(jī)、凈化罐。其中，凈化罐內(nèi)布置下層活性炭蓬松氈過(guò)濾網(wǎng)和上層活性炭蓬松氈過(guò)濾網(wǎng)，這兩個(gè)過(guò)濾網(wǎng)可以對(duì)沒(méi)有得到利用的相應(yīng)環(huán)境進(jìn)行凈化處理，保證周?chē)諝獠粫?huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境造成污染以及影響試驗(yàn)人員的健康。

此裝置可有效監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中煙霧的成分、濃度、溫度、濕度，同時(shí)使煙霧循環(huán)利用，徹底解決實(shí)驗(yàn)過(guò)程中造成試驗(yàn)效果欠佳的問(wèn)題。

4 結(jié)語(yǔ)

建立動(dòng)物模型的首要基礎(chǔ)是研究疾病的預(yù)防、新藥的研發(fā)以及新療法。裝置合格的模型可以使臨床研究順利開(kāi)展。在實(shí)驗(yàn)室的眾多研究成果中，該環(huán)節(jié)在臨床中的應(yīng)用不可或缺。至今，我國(guó)醫(yī)藥技術(shù)行業(yè)仍然在持續(xù)尋找能夠與動(dòng)物造模相匹配的辦法，以期實(shí)現(xiàn)規(guī)范化。目前，更符合COPD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的條件是應(yīng)用復(fù)合因素造模，但需要通過(guò)多個(gè)方面標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)與考查，確定存在特殊病理的改變、通氣功能的限制等因素，來(lái)確定模型是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，更先進(jìn)的動(dòng)物模型以及更全面的評(píng)價(jià)系統(tǒng)的出現(xiàn)可為后續(xù)研究COPD提供更多的幫助。