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        基于Nrf2/HO-1信號(hào)通路探討lncRNA H19對(duì)支原體感染肺炎小鼠肺組織的影響

        2022-10-07 07:25:30李偉華山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院急診科濟(jì)南250031
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年14期
        關(guān)鍵詞:肺泡支原體通路

        張 曉 李偉華(山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院急診科,濟(jì)南 250031)

        肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniaepneumonia,MPP)是由肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)引起的呼吸道感染性肺炎,通常表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與感染引起的上皮細(xì)胞凋亡和機(jī)體的過度免疫應(yīng)答有關(guān),主要包括免疫細(xì)胞激活和細(xì)胞炎癥因子分泌[1-2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類核苷酸長(zhǎng)度大于200 nt、無編碼蛋白質(zhì)功能的RNA,可參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程,還能夠調(diào)節(jié)信號(hào)通路參與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。研究表明lncRNA H19與人類多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),如ZHONG等[4]發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA H19后,肺癌細(xì)胞增殖減少,細(xì)胞周期停滯在G1期,細(xì)胞凋亡水平提高,遷移和侵襲減少。LIU等[5]表明過表達(dá)lncRNA H19可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549發(fā)生上皮-間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),并促進(jìn)細(xì)胞增殖及侵襲。WAN等[6]發(fā)現(xiàn)H19 mRNA在特發(fā)性肺纖維化患者及博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中上調(diào),lncRNA H19缺乏可改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺部炎癥和纖維化。感染性肺炎患者體內(nèi)免疫功能損傷,炎癥反應(yīng)激烈。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)能夠調(diào)節(jié)多種抗炎和抗氧化基因的表達(dá),在機(jī)體損傷應(yīng)答中居核心地位,而血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是Nrf2發(fā)揮作用的重要媒介。Nrf2/HO-1信號(hào)通路參與多種組織器官的炎癥相關(guān)病理過程。如SHEN等[7]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞外泌體可以通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1的表達(dá)將巨噬細(xì)胞極化為抗炎表型,并改善膿毒癥中的炎癥反應(yīng)和損傷。KHADRAWY等[8]發(fā)現(xiàn)在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)抑制氧化應(yīng)激、炎癥和肝纖維化。ARKALI等[9]發(fā)現(xiàn)香芹酚對(duì)雄性大鼠糖尿病誘導(dǎo)的生殖損傷具有保護(hù)作用,通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制NF-κB介導(dǎo)的睪丸細(xì)胞凋亡和炎癥。而Nrf2/HO-1信號(hào)通路在支原體感染的肺炎中鮮有報(bào)道。

        因此,本研究通過構(gòu)建支原體感染肺炎小鼠模型及肺泡上皮細(xì)胞A549模型,探究lncRNA H19通過調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路對(duì)小鼠肺組織的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)4周齡BALB/c小鼠60只,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,購自豪威生物科技有限公司[SYXK(津)2019-0006]。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23~25℃、標(biāo)準(zhǔn)濕度55%~60%、12 h/12 h晝夜交替、飲水飲食正常、分籠飼養(yǎng),并于1周后實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20190523)。

        1.1.2 主要試劑和儀器肺炎支原體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC FH15531購自美國(guó)菌種保藏中心;肺泡上皮細(xì)胞A549購自上海生工生物公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BCL2-associated X protein,Bax)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)抗體購自美國(guó)CST公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自北京博爾西科技有限公司;CyclinD1、Nrf2、HO-1抗體購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司;TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Thermo酶標(biāo)儀購自上海熱電儀器有限公司;冷凍離心機(jī)購自美國(guó)Beckman公司;組織包埋機(jī)購自德國(guó)Leica公司;蛋白電泳、儀轉(zhuǎn)膜儀購自美國(guó)伯樂公司;電子顯微鏡購自日本Olympus公司。

        1.2 方法

        1.2.1 動(dòng)物模型制作與分組利用10倍稀釋法將待測(cè)菌液用培養(yǎng)基稀釋成1×10-12~1×10-1CCU/ml一系列濃度,于37℃恒溫培養(yǎng),以培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色時(shí)的最高稀釋度為待測(cè)菌液的CCU,菌液濃度以1×107CCU/ml。

        將60只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:對(duì)照組(control組)、模型組(MP組)、轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照組(si-NC組)和轉(zhuǎn)染lncRNA H19 siRNA組(si-H19組)。各組小鼠均腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉,si-NC組鼻腔滴入陰性對(duì)照siRNA,si-H19組滴入lncRNA H19 siRNA,對(duì)照組和模型組滴入等量生理鹽水。24 h后,除對(duì)照組外,其余組用1 ml注射器緩慢向鼻腔中滴入0.1 ml 1×107CCU/ml的MP菌液,對(duì)照組滴入等量培養(yǎng)基,1次/d,連續(xù)滴鼻3 d造模。造模結(jié)束后,頸椎脫臼處死小鼠,打開胸腔,剝離肺組織樣本,觀察病變程度;部分置于4%多聚甲醛中固定,用于HE染色和免疫組化;部分置于-80℃凍存,用于ELISA、qRTPCR和Western blot檢測(cè)。

        1.2.2 細(xì)胞模型制作與分組A549細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將A549細(xì)胞分為對(duì)照組(control組)、模型組(MP組)、轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照組(si-NC組)、轉(zhuǎn)染lncRNA H19 siRNA組(si-H19組)、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒組(pcDNA-NC組)和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA H19質(zhì)粒組(pcDNA-H19組)。各組分別轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的RNA及質(zhì)粒。24 h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。除對(duì)照組外,其余組使用1×107CCU/ml的MP菌液感染A549細(xì)胞,4 h后,洗去未黏附的MP,并用RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.3 HE染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變?nèi)〕?%多聚甲醛固定的肺組織,將樣品包埋石蠟制成3μm厚的切片,后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木精-伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性膠封固等,最后于顯微鏡(×200)下觀察肺組織結(jié)構(gòu)。

        1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)肺組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19 mRNA的表達(dá)采用Trizol試劑從肺組織和細(xì)胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并使用SYBR Green法進(jìn)行擴(kuò)增,GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃45 s,60℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt公式計(jì)算lncRNA H19的相對(duì)表達(dá)水平。lncRNA H19正向引物序列:5"-TGAAGGAACAGACGGTGACAACATC-3",反向引物序列:5"-TAGAGGCTTGGCTCCAGGATGATG-3"。GAPDH正向引物序列:5"-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3",反向引物序列:5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。

        1.2.5 ELISA檢測(cè)肺組織和細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量取出小鼠凍存的肺組織和A549細(xì)胞,低溫超聲勻漿裂解,收集組織和細(xì)胞上清液,按照ELISA試劑盒說明,稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)小鼠組織和細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

        1.2.6 免疫組化染色觀察小鼠肺組織Bcl-2、Bax、MMP-9的表達(dá)將切片于60℃烤箱熔蠟,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,進(jìn)行高壓抗原修復(fù),3%H2O2室溫浸泡,PBS洗滌3次,分別滴加兔抗大鼠一抗Bcl-2、Bax、MMP-9(1∶100)4℃孵育過夜,PBS洗滌,次日滴加山羊抗兔二抗孵育20 min,快速滴加DAB顯色液顯色,蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水、透明、封片,顯微鏡(×200)下觀察,使用ImageProPlus 6.0軟件分析陽性染色區(qū)域的平均光密度值(equally optical density,EOD)。

        1.2.7 細(xì)胞單克隆形成及MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力單克隆形成實(shí)驗(yàn):調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/孔接種于6孔板培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10 d后,用4%多聚甲醛溶液固定,用結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡(×40)觀察菌落形成情況并拍照。MTT實(shí)驗(yàn):調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/孔并接種于96孔板培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h,加入MTT溶液,37℃孵育4 h,離心去上清,加入DMSO,使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

        1.2.8 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡能力調(diào)整細(xì)胞密度為1×103個(gè)/孔并接種于6孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,細(xì)胞培養(yǎng)48 h后進(jìn)行胰酶消化,離心后收集細(xì)胞,加入500μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞,再各加入5μl Annexin V-FITC及PI混勻,室溫避光孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        1.2.9 Western blot檢測(cè)肺組織和細(xì)胞中Nrf2、HO-1、CyclinD1蛋白表達(dá)取凍存的肺組織和A549細(xì)胞,低溫超聲勻漿裂解提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,取等質(zhì)量蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,加入Nrf2、HO-1、CyclinD1一抗(1∶2 000)4℃過夜,TBST漂 洗3次,加入 二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h,TBST漂洗3次,用ECL發(fā)光劑顯影,Quantity One軟件進(jìn)行各組蛋白灰度分析,GAPDH為內(nèi)參校正。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析應(yīng)用軟件SPSS16.0,作圖軟件采用GraphPad Prism 5.0,計(jì)量資料以±s表示,采用獨(dú)立t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 lncRNA H19對(duì)支原體感染肺炎小鼠肺組織的影響HE染色觀察小鼠肺組織形態(tài),結(jié)果顯示:對(duì)照組雙肺呈粉紅色,肺泡壁光滑有彈性,無充血,鏡下肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔大小一致,肺泡壁薄,無間隔水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);MP組、si-NC組雙肺塌陷,表面粗糙,呈灰白色,均勻分布點(diǎn)狀淤血斑點(diǎn),鏡下肺泡大量塌陷,肺泡間隔增厚,出現(xiàn)不同程度增生,甚至融合為大肺泡,肺泡內(nèi)有充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);si-H19組情況較MP組肺部形態(tài)有所改善,雙肺較紅潤(rùn),存在肺泡結(jié)構(gòu),但局部可見少量肺塌陷及肺泡間隔增厚,少量肺泡融合,見圖1A。說明敲減lncRNA H19會(huì)改善肺部病理形態(tài)。qRT-PCR檢測(cè)lncRNA H19 mRNA在肺組織中的表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MP組、si-NC組lncRNA H19 mRNA水平升高(P<0.05);與si-NC組相比,si-H19組lncRNA H19 mRNA水平降低(P<0.05),見圖1B。說明lncRNA H19在肺炎組織中表達(dá)升高。ELISA檢測(cè)肺組織炎癥因子的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,MP組、si-NC組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與si-NC組相比,si-H19組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05),見圖1C。說明敲降lncRNA H19能夠降低小鼠肺組織炎癥因子水平。免疫組化和Western blot檢測(cè)了增殖、凋亡及Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,MP組、si-NC組CyclinD1、Bcl-2蛋白水 平 降低,Bax、MMP-9、Nrf2、HO-1蛋 白水 平升 高(P<0.05);與si-NC組相比,si-H19組CyclinD1、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白水平升高,Bax、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),見圖1D、E。說明敲降lncRNA H19可能通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。綜上,敲降lncRNA H19水平對(duì)支原體感染肺炎小鼠肺組織具有保護(hù)作用。

        圖1 lncRNA H19對(duì)支原體感染肺炎小鼠肺組織的影響Fig.1 Effect of lncRNA H19 on lung tissue of mice with mycoplasma infection with pneumonia

        2.2 lncRNA H19對(duì)支原體感染A549細(xì)胞的影響qRT-PCR檢測(cè)lncRNA H19 mRNA在A549細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,MP組lncRNA H19 mRNA水平升高(P<0.05);與si-NC組相比,si-H19組lncRNA H19 mRNA水平降低(P<0.05);與pcDNA-NC組 相 比,pcDNA-H19組lncRNA H19 mRNA水平升高(P<0.05),見圖2A。說明支原體感染后lncRNA H19表達(dá)升高。ELISA檢測(cè)A549細(xì)胞炎癥因子的表達(dá),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,MP組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);與si-NC組相比,si-H19組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-H19組TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05),見圖2B。說明敲降lncRNA H19水平能夠降低A549細(xì)胞炎癥因子水平,而過表達(dá)lncRNA H19提高炎癥因子水平。單克隆形成、MTT法、Annexin V-FITC/PI染色及Western blot對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡情況和Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,MP組單克隆數(shù)減少,24 h、48 h、72 h、96 h OD值降低,細(xì)胞凋亡率升高,CyclinD1水平降低,Nrf2、HO-1水平升高(P<0.05);與si-NC組相比,si-H19組單克隆數(shù)增多,24 h、48 h、72 h、96 h OD值升高,細(xì)胞凋亡率降低,Nrf2、HO-1、CyclinD1水平升高(P<0.05);與pcDNA-NC組相比,pcDNA-H19組單克隆數(shù)減少,24 h、48 h、72 h、96 h OD值降低,細(xì)胞凋亡率升高,CyclinD1、Nrf2、HO-1水平降低(P<0.05),見圖2C~F。說明敲降lncRNA H19可能通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。綜上,敲降lncRNA H19水平對(duì)A549細(xì)胞具有保護(hù)作用,而過表達(dá)lncRNA H19損傷A549細(xì)胞。與支原體感染肺組織結(jié)果一致。

        圖2 lncRNA H19對(duì)支原體感染A549細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of lncRNA H19 on mycoplasma infection of A549 cells

        圖3 lncRNA H19基于Nrf2/HO-1信號(hào)通路調(diào)控支原體感染肺炎的作用機(jī)制Fig.3 Mechanism of lncRNA H19 in regulating mycoplasma infection pneumonia based on Nrf2/HO-1 signaling pathway

        2.3 lncRNA H19調(diào)控支原體感染肺炎的作用機(jī)制構(gòu)建支原體感染肺炎小鼠模型及A549細(xì)胞模型,發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在支原體感染的肺組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。敲減lncRNA H19后,促進(jìn)了細(xì)胞增殖,并抑制了細(xì)胞凋亡及炎癥水平,同時(shí)Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)增加;而過表達(dá)lncRNA H19能挽救上述影響。由此推斷敲減lncRNA H19能夠減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)(圖3)。

        3 討論

        肺炎支原體感染引起的MPP占社區(qū)獲得性肺炎的40%,容易在兒童中暴發(fā)流行,能夠造成患者肺部嚴(yán)重?fù)p傷,甚至威脅生命[10]。lncRNA H19位于人11號(hào)染色體和小鼠7號(hào)染色體上,是肺損傷和炎癥的重要調(diào)節(jié)因子。如劉江華等[11]發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中高表達(dá)。趙炎等[12]發(fā)現(xiàn)敲減lncRNA H19能夠提高肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活性,抑制炎癥因子的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡。ZHANG等[13]發(fā)現(xiàn)支氣管肺發(fā)育不良小鼠模型H19上調(diào),肺部出現(xiàn)充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),下調(diào)lncRNA H19通過下調(diào)STAT3引起的炎癥反應(yīng),從而減輕肺損傷。本研究肺炎支原體感染的肺炎小鼠模型和A549細(xì)胞模型中,lncRNA H19也呈現(xiàn)高表達(dá),且肺部病理學(xué)顯示,肺炎模型組雙肺塌陷呈灰白色,肺泡間隔增厚,內(nèi)有充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而敲減lncRNA H19后,肺部形態(tài)及結(jié)構(gòu)明顯改善,局部?jī)H見少量肺塌陷及肺泡間隔增厚。說明lncRNA H19可能參與了支原體感染肺炎的發(fā)生、發(fā)展。

        MP感染導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂,產(chǎn)生炎癥浸潤(rùn),釋放TNF-α、IL-6和IL-1等細(xì)胞炎癥因子。TNF-α是早期細(xì)胞炎癥因子,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的釋放,誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)。IL-6是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),參與整個(gè)炎癥反應(yīng),在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。MMP-9是金屬蛋白酶類家族成員,由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,Nrf2/HO-1級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)肺組織中的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡均具有顯著的抑制作用[14]。如張潔等[15]發(fā)現(xiàn),MP感染后血清TNF-α和IL-6水平與感染程度呈正相關(guān),其水平可準(zhǔn)確反映患者病情。李娜等[16]研究結(jié)果表明,祛濕通絡(luò)方通過下調(diào)MP感染的RAW264.7細(xì)胞的TNF-α、IL-6的高表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)。曹波等[17]發(fā)現(xiàn)VD3通過下調(diào)NF-κB及MMP-9表達(dá),降低肺炎支原體感染小鼠肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)。AMATA等[18]研究發(fā)現(xiàn),Nrf2/HO-1在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒肺損傷反應(yīng)中被激活,從而誘導(dǎo)一系列抗炎信號(hào)的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,MP組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺組織和A549細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、MMP-9、Nrf2和HO-1水平升高;敲減lncRNA H19后各炎癥因子水平降低,Nrf2和HO-1水平升高;過表達(dá)lncRNA H19后各炎癥因子水平升高,Nrf2和HO-1水平降低。說明MP感染激活機(jī)體免疫應(yīng)答,促發(fā)炎癥反應(yīng),而敲減lncRNA H19通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制炎癥產(chǎn)生。

        MP感染細(xì)胞后,可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2家族成員,二者協(xié)同調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡。CyclinD1是促增殖基因,參與細(xì)胞周期的調(diào)控,能夠促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)展,增強(qiáng)細(xì)胞活力。李向峰等[19]研究結(jié)果表明,魚腥草總黃酮通過升高肺炎支原體感染小鼠肺組織Bcl-2蛋白和mRNA水平,降低Bax蛋白和mRNA水平,抑制細(xì)胞凋亡。楊志敏等[20]發(fā)現(xiàn)芩百清肺濃縮丸能促進(jìn)肺炎支原體感染的A549細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。吳振起等[21]發(fā)現(xiàn)清燥救肺湯以Bax、Bcl-2為效應(yīng)靶點(diǎn),抑制Caspase-3的表達(dá),使細(xì)胞可以免于凋亡。孫小單等[22]表明阿帕替尼通過下調(diào)NRF2/HO-1通路,抑制卵巢癌CAOV-3細(xì)胞內(nèi)Bcl-2水平,提高Bax水平,發(fā)揮抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。本研究中與對(duì)照組相比,MP組小鼠肺組織Bcl-2、CyclinD1表達(dá)降低,Bax表達(dá)升高;敲減lncRNA H19后Bcl-2、CyclinD1表達(dá)升高,Bax表達(dá)降低;過表達(dá)lncRNA H19后Bcl-2、CyclinD1表達(dá)降低,Bax表達(dá)升高。同時(shí)支原體感染A549細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)也表明敲減lncRNA H19能促進(jìn)MP感染細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,lncRNA H19在支原體感染肺炎小鼠肺組織中表達(dá)上調(diào),敲降lncRNA H19能夠減輕小鼠肺部炎癥反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡,其機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。

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