劉驍蒨，向 葵，桂全安

（1.武漢商學(xué)院體育學(xué)院/國際馬術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430056；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 成都 611130）

中國有著悠久的養(yǎng)馬歷史，也是馬種資源非常豐富的國家之一。伊犁馬是我國最重要和最優(yōu)秀的地方馬種之一[1-4]，其皮毛粗厚、四肢短粗、肩短直立、背腰平直、胸廓寬深、鬃甲低寬、頭頸粗重，具有抗病力強(qiáng)、耐寒、適應(yīng)性強(qiáng)等特性[5-6]。其抗病耐寒等特性與腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性密切相關(guān)[7]。研究表明，腸道菌群對(duì)馬腸道黏膜扮有著雙重功效，一方面，腸道菌群及其代謝物對(duì)腸道黏膜有危害，如毒素、多胺類、吲哚衍生物[8]；另一方面，腸道菌群及其代謝物會(huì)產(chǎn)生一些營養(yǎng)物質(zhì)，滿足宿主腸道的需求，激活腸道免疫，如提高免疫因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-8 的含量[9]。然而，目前人們對(duì)該領(lǐng)域的關(guān)注極少。因此，加大我國優(yōu)良地方馬腸道菌群的研究，開發(fā)相關(guān)微生物類制劑對(duì)馬無抗養(yǎng)殖和疫病的生物防控具有重要意義。

紅樹莓（Rubus ideausL.）是薔薇科懸鉤子屬灌木植物，其果實(shí)富含氨基酸、黃酮、花青素、維生素、多糖等，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、改善菌群結(jié)構(gòu)等功效[10]。酵素是指用一種或多種果蔬破碎、榨汁后，添加一種或多種益生菌發(fā)酵而來，富含多種次級(jí)代謝物、生物酶、維生素等[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)紅樹莓具有較高的抗氧化活性[12]，將其加入益生菌發(fā)酵后可能會(huì)對(duì)動(dòng)物腸道菌群及免疫系統(tǒng)產(chǎn)生積極影響。為驗(yàn)證該推測是否正確，本研究通過在伊犁馬日飼料中添加紅樹莓酵素，研究其對(duì)伊犁馬腸道菌群結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)的影響，并初步確定其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料紅樹莓酵素購自山東天隨生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SC10637150100152；24匹健康狀況良好、遺傳背景一致、公母各半的伊犁馬購自新疆伊犁哈薩克自治州伊犁地區(qū)。堿性磷酸酶活性測定試劑盒購自南京建成有限公司； TRIzol試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix 和qPCR 試劑盒，均購自TaKaRa 公司；免疫因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-8 的ELISA 檢測試劑盒，均購自上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將24匹伊犁馬每組公母各半隨機(jī)平均分為4 組，分別為空白對(duì)照組、低劑量紅樹莓酵素添加組（0.1 g/kg）、中劑量紅樹莓酵素添加組（0.2 g/kg）和高劑量紅樹莓酵素添加組（0.4 g/kg），實(shí)驗(yàn)周期28 d?？瞻讓?duì)照組馬正常飼養(yǎng)，各紅樹莓酵素添加組馬每日于日糧中添加上述相應(yīng)劑量的紅樹莓酵素。根據(jù)NRC（1998）中馬匹營養(yǎng)需求配制日糧[13]，分欄飼養(yǎng)于北京京華興馬場馬匹馴養(yǎng)中心，溫度控制在25 ℃～28 ℃，濕度控制在60%左右，自由采食和飲水，其他日常管理均參照常規(guī)馬飼養(yǎng)管理方法。

1.3 各組馬腸道微生物菌群的測定實(shí)驗(yàn)期間觀察各實(shí)驗(yàn)組伊犁馬的腹瀉狀況，確定紅樹莓酵素是否對(duì)馬具有毒副作用。確定無影響后于實(shí)驗(yàn)第28 d，每組選取2 匹健康狀況良好、個(gè)頭中等的伊犁馬，用戊巴比妥鈉將其麻醉后，采集帶有食糜的盲腸腸段和小腸腸段，包括十二指腸、回腸、空腸、結(jié)腸等，參考劉永忠等[14]方法測定腸道微生物菌群，分析紅樹莓酵素對(duì)伊犁馬腸道菌群的影響，同時(shí)測定各組馬各腸道pH 值。

1.4 各組馬小腸黏膜纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測取1.3中帶有食糜的小腸腸段，腸道利用TRIzol試劑盒從馬腸組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)已經(jīng)登錄的纖維素酶關(guān)鍵酶基因melA序列，設(shè)計(jì)引物5'-TGCTCTAGATATGAAACGGTCAATCTCTAT-3'/5'-C CAAGCTTCTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3'，以獲得的cDNA 為模板，利用qPCR 試劑盒檢測伊犁馬小腸黏膜中纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測選取各組剩余實(shí)驗(yàn)馬中的2 匹，采集各腸段制作切片，均采用電鏡觀察整個(gè)消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.6 各組馬外周血單核細(xì)胞中免疫因子轉(zhuǎn)錄水平的測定采用前腔靜脈采血法，于剖殺前采集1.5中各組馬抗凝血，采用非連續(xù)性密度梯度離心法分離單核細(xì)胞，利用TRIzol試劑盒提取單核細(xì)胞總RNA后，采用PrimeScriptTMRT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，分別采用表1中相應(yīng)引物，利用qPCR試劑盒檢測各組馬外周血單核細(xì)胞中TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-6、IL-8基因的轉(zhuǎn)錄水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7 紅樹莓酵素對(duì)各組馬外周血中免疫因子表達(dá)水平的影響取1.6中采集的各組馬前腔靜脈血，分離血清，利用相應(yīng)ELISA 試劑盒檢測各組實(shí)驗(yàn)馬血中免疫因子TNF-α、IFN-β、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理本研究中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 進(jìn)行分析，結(jié)果以“-x±s”表示，P＜0.05 表示二者間差異顯著，P＜0.01 表示二者間差異極其顯著。

2 結(jié) 果

2.1 紅樹莓酵素對(duì)伊犁馬腸道菌群及pH 值影響的檢測觀察各組伊犁馬腹瀉狀況，結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組馬腹瀉狀況均無差異（P＞0.05），表明飼喂紅樹莓酵素不會(huì)影響伊犁馬基本健康，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

采集各組馬各腸段食糜，檢測腸道菌群，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，紅樹莓酵素添加后伊犁馬空腸和盲腸總菌（大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌）含量顯著增加（P＜0.05），且增幅與紅樹莓酵素添加量成正比（表2）。進(jìn)一步對(duì)各腸段pH值檢測，結(jié)果顯示，紅樹莓酵素可以改善伊犁馬腸道pH 值，使其維持在6.25～7.25，有利于益生菌菌群存活增殖，且各腸段均以紅樹莓酵素高劑量添加組改善最明顯（表3）。上述結(jié)果表明，飼喂紅樹莓酵素后可能會(huì)通過影響伊犁馬腸道pH 值來改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

表2 紅樹莓酵素對(duì)伊犁馬腸道菌群影響的檢測結(jié)果Table 2 The effect of red raspberry enzyme on the intestinal flora of Yili horse

表3 紅樹莓酵素對(duì)伊犁馬腸道pH值影響的測定結(jié)果Table 3 The effect of mangrove enzymes on the pH value of the intestine of Yili horse

2.2 各組馬小腸黏膜纖維素酶melA基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果采用qPCR 檢測各組伊犁馬小腸黏膜中melA基因轉(zhuǎn)錄的情況，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，紅樹莓酵素高劑量添加組和中劑量添加組中melA基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著增高（P＜0.01），其次是紅樹莓酵素低劑量添加組顯著升高（P＜0.05），且melA基因轉(zhuǎn)錄水平與紅樹莓酵素劑量呈正相關(guān)（圖1）。表明紅樹莓酵素能夠增加伊犁馬腸道中菌群和消化能力。

圖1 各組伊犁馬小腸黏膜中纖維素酶melA基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig.1 Expression of cellulase gene in small intestinal mucosa of Yili horse

2.3 紅樹莓酵素對(duì)伊犁馬腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響電鏡下觀察各組馬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，各組伊犁馬空腸比較，紅樹莓酵素高劑量添加組空腸絨毛排列整齊且密集，長度也略有增加，黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于其他組；其次是紅樹莓酵素中劑量添加組，最后是紅樹莓酵素低劑量添加組和空白對(duì)照組（圖2）。而其他腸道，如十二指腸腸、結(jié)腸、回腸及盲腸等的黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較較無明顯差異（圖略）。表明高劑量的紅樹莓酵素有助于伊犁馬小腸黏膜良好發(fā)育。

圖2 紅樹莓酵素對(duì)伊犁馬空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育的影響Fig.2 The effects of red raspberry enzymes on the morphological structure and development of the jejunum mucosa of Yili horse

2.4 各組馬外周血單核細(xì)胞中免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測定結(jié)果利用qPCR 檢測各組馬外周血單核細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，馬外周血單核細(xì)胞中免疫因子TLR4、CD14、MD2、IFN-β基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)（P＜0.01），而TNF-α、IL-1β、IL-8均顯著下調(diào)（P＜0.01），且調(diào)節(jié)幅度與紅樹酶毒素添加劑量成正比。TLR4是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖的識(shí)別受體，其識(shí)別還需要CD14、MD2 等因子共同參與，激活下游MyD88 非依賴通路，進(jìn)而引起I 型干擾素IFN-β 等表達(dá)。本研究中紅樹莓酵素添加后，會(huì)引起馬外周血免疫因子CD14、MD2基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，有助于TLR4 受體的識(shí)別，從而激活MyD88 非依賴通路，促進(jìn)I 型干擾素IFN-β 表達(dá)（圖3）。表明紅樹莓酵素通過增加伊犁馬免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平來增強(qiáng)馬免疫系統(tǒng)的免疫應(yīng)答。

圖3 各組伊犁馬外周血單核細(xì)胞中免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig.3 Transcription level of immune-related genes in monocytes of Yili horse

2.5 各組馬外周血免疫因子表達(dá)水平的測定結(jié)果中高劑量紅樹莓酵素添加后，馬外周血免疫因子檢測結(jié)果顯示，免疫因子IFN-β 的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），TNF-α、IL-1β、IL-8 的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05），且調(diào)節(jié)幅度與紅樹莓酵素的劑量相關(guān)。可見各組炎性相關(guān)的免疫因子TNF-α、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平均下調(diào)，參與吞噬、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、脂質(zhì)代謝、凝固和神經(jīng)傳遞等生物調(diào)節(jié)過程的IFN-β表達(dá)上調(diào)，與2.4的結(jié)果一致（圖4）。但低劑量紅樹莓酵素添加組各免疫因子變化不顯著。進(jìn)一步表明紅樹莓酵素能夠減少機(jī)體的炎性反應(yīng)，增強(qiáng)伊犁馬免疫系統(tǒng)，且該作用對(duì)紅樹莓酵素呈劑量依賴性。

圖4 各組馬外周血中免疫因子表達(dá)水平的測定結(jié)果Fig.4 Determination of immune factor content

3 討 論

胃腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)是人和動(dòng)物體內(nèi)最龐雜的生物系統(tǒng)。機(jī)體內(nèi)腸道菌群會(huì)隨著生長環(huán)境的改變而改變，并且不同消化部位種群數(shù)量和種類也有所差異[15]。研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌能夠顯著改善吡嗪酰胺致肝損傷大鼠的腸道菌群紊亂[16-17]；賀燕等研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門、變形菌門、脫鐵桿菌門等能夠顯著損傷小鼠腸道黏膜[18]。由于腸道菌群對(duì)機(jī)體腸道狀況有著非常重要的作用，因此研究機(jī)體腸道菌群結(jié)構(gòu)具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)空腸中，與對(duì)照組相比，紅樹莓酵素添加后伊犁馬空腸總菌含量顯著增加（P＜0.05），且增加幅度與紅樹莓酵素含量成正比。對(duì)空腸總菌分析結(jié)果顯示，其總菌中含有大量雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌，且菌群結(jié)構(gòu)也得到改善。

小腸的主要功能是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)。趙冰婕等研究發(fā)現(xiàn)，紅樹莓酵素能夠顯著改善I 型糖尿病小鼠腸道菌群，且對(duì)其代謝物有顯著影響[19]。本研究通過電鏡觀察結(jié)果顯示，紅樹莓酵素高劑量添加組改善空腸絨毛效果最顯著，其排列整齊且密集，長度也略有增加；其次是紅樹莓酵素中劑量添加組、紅樹莓酵素低劑量添加組和空白對(duì)照組。而其他腸道，如十二指腸腸、結(jié)腸、回腸及盲腸等形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著差異。電鏡下觀察伊犁馬各組空腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)紅樹莓酵素高劑量添加組效果最好。推測紅樹莓酵素能夠改善動(dòng)物腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。可見紅樹莓酵素對(duì)腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的改善有利于提高機(jī)體免疫力，該推測也通過本實(shí)驗(yàn)后續(xù)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組馬機(jī)體免疫因子的變化檢測得到印證。

研究發(fā)現(xiàn)，宿主口服益生菌（包括來源于原籍菌群和外籍菌群）后，可使分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）分泌增強(qiáng)，提高機(jī)體免疫識(shí)別力，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和T、B 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，增強(qiáng)宿主免疫功能[20]，因此腸道益生菌群與宿主免疫有密切關(guān)系。為了驗(yàn)證紅樹莓酵素是否通過改善腸道益生菌群結(jié)構(gòu)來提高機(jī)體免疫能力，本研究通過檢測外周血中免疫因子的表達(dá)和外周血單核細(xì)胞中免疫因子的轉(zhuǎn)錄水平，分析紅樹莓酵素對(duì)伊利馬機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制。TLR4 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖的識(shí)別受體，研究表明，TLR4 受體識(shí)別還需要CD14、MD2 等共同參與，激活下游MyD88 依賴和非依賴通路[21]。MyD88 依賴通路進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等表達(dá)；MyD88非依賴途徑則會(huì)引起I 型干擾素IFN-β 等表達(dá)[22]。本研究檢測伊犁馬外周血單核細(xì)胞中免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，紅樹莓酵素處理后，伊犁馬外周血周中免疫因子CD14、MD2、TLR4、IFN-β轉(zhuǎn)錄水平會(huì)顯著升高（P＜0.05），而炎性相關(guān)的TNF-α、IL-1β、IL-8 的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低（P＜0.05），且升高與降低幅度均具有紅樹莓酵素劑量依賴性。進(jìn)一步可見添加紅樹酶酵素有助于CD14、MD2 參與TLR4受體識(shí)別，偏向于激活MyD88 非依賴通路，從而促進(jìn)具有增強(qiáng)免疫功能的I 型干擾素IFN-β 的表達(dá)，而MyD88 依賴通路相對(duì)被抑制，避免促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等表達(dá)水平提高。進(jìn)一步利用ELISA 檢測伊犁馬外周血中免疫相關(guān)因子的表達(dá)水平，與上述結(jié)果一致。可見紅樹莓酵素可能是通過激活革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖受體TLR4，進(jìn)而調(diào)控其下游MyD88 依賴和非依賴通路，提高機(jī)體免疫反應(yīng)，減少機(jī)體炎性反應(yīng)。

腸道作為宿主最大的免疫器官具有完善的免疫功能，同時(shí)腸道菌群除了對(duì)宿主有多種有益的生理和營養(yǎng)作用外，還具有促進(jìn)宿主免疫系統(tǒng)形成和成熟、在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、增強(qiáng)免疫力等方面起著重要作用[23]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，腸道結(jié)構(gòu)及菌群對(duì)宿主的影響研究已進(jìn)入細(xì)胞和基因?qū)用妫芯堪l(fā)現(xiàn)能夠改善腸道菌群及腸道組織結(jié)構(gòu)的藥劑，尤其是天然制劑，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)增強(qiáng)及其疾病微生態(tài)療法具有重要的意義。本研究通過給伊犁馬添加紅樹莓酵素，首次證實(shí)紅樹莓酵素通過改變腸道pH 值促使腸道益生菌群數(shù)量顯著增加，同時(shí)優(yōu)化了腸道黏膜形態(tài)，增強(qiáng)了伊犁馬機(jī)體免疫力，但相關(guān)具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究，本研究為馬的無抗養(yǎng)殖和疫病生物防控奠定了基礎(chǔ)。