王成賓，胡驍飛，孫亞寧，邢云瑞，龐杏豪，王琳，吳佳蓓，王耀

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南省食品綠色加工與質(zhì)量安全控制國際聯(lián)合實驗室，河南 洛陽，471023)2(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州，450002)

花生是重要的經(jīng)濟(jì)作物，約含有50%的脂肪，25%～30%的蛋白質(zhì)，10%～13%的碳水化合物，以及微量的維生素B1、維生素B6等天然營養(yǎng)物質(zhì)，被認(rèn)為是煙酸、維生素E的良好來源，有著“長生果”的美譽(yù)。研究表明，攝入這些營養(yǎng)物質(zhì)對健康有廣泛的益處，如降低患癌癥的風(fēng)險、促進(jìn)心臟健康、保持認(rèn)知和思維能力等[1-2]。對于大多數(shù)人來說，花生攝入量的增加可以被認(rèn)為是一種營養(yǎng)優(yōu)勢。然而，對于花生過敏患者來說，食用含有未標(biāo)識花生成分的食品會造成嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization, FAO)的最新統(tǒng)計，花生被認(rèn)定為最嚴(yán)重的食物致敏物之一[3]，其引起的過敏占食品過敏總量的7%～20%[4]。與其他食物過敏對比，花生導(dǎo)致的過敏癥狀極其嚴(yán)重，極低的攝入量就能引發(fā)過敏反應(yīng)，可導(dǎo)致消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、皮膚等損傷，甚至引起過敏性休克危及生命[5]。而且花生過敏人群大多數(shù)是終身的，只有10%的過敏人群可能會隨年齡的增長產(chǎn)生耐受，花生過敏不僅造成過敏患者健康損害，還嚴(yán)重影響個人及其家庭的生活質(zhì)量。

目前，針對花生過敏尚缺乏準(zhǔn)確的治療方案[6]，對致敏成分進(jìn)行準(zhǔn)確標(biāo)識、避免食用致敏食品仍是保障過敏患者食品安全的主要途徑。美國、歐盟發(fā)達(dá)國家和地區(qū)制定了相關(guān)法律法規(guī)，嚴(yán)格規(guī)定預(yù)包裝食品和配料標(biāo)簽必須標(biāo)示致敏成分。2018年我國對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》(GB 7718)修訂草案進(jìn)行征求意見，該草案中將致敏物質(zhì)標(biāo)示由推薦性條款變?yōu)閺?qiáng)制性條款。因此，為更好地保障廣大消費(fèi)者的身體健康，減少花生過敏可能造成的危害,本文分別從蛋白質(zhì)和DNA水平對花生致敏蛋白檢測方法進(jìn)行歸納分析，對深入研究花生致敏蛋白的檢測方法和預(yù)防花生過敏具有重要參考價值。

1 花生致敏蛋白

根據(jù)國際免疫學(xué)聯(lián)合會過敏原命名委員會(International Union of Immunological Societies, IUIS)公布的最新數(shù)據(jù)，共有18種花生致敏蛋白(Ara h l～Ara h 18)已被認(rèn)可[7]。其中大多是種子貯藏蛋白，糖基化程度非常高，分子質(zhì)量為0.7～100 kDa(表1)[8]。Ara h l是分子質(zhì)量為64 kDa的糖蛋白，占花生總蛋白量的12%～16%，通過分析發(fā)現(xiàn)此類蛋白為花生中含量最高的致敏蛋白，且多數(shù)過敏患者的血清能成功識別[9]。相關(guān)學(xué)者通過實驗表明，在天然狀態(tài)下Ara h l主要以水溶性蛋白的形式存在，具有高度穩(wěn)定的三聚體結(jié)構(gòu)(圖1)[10]。Ara h 2占花生總蛋白量的5.9%～9.3%，含有8個半胱氨酸殘基，可以形成較多的二硫鍵，使其在100 ℃的高溫下仍能保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且抗酶解[11]。通過與大豆進(jìn)行高度對比發(fā)現(xiàn)，Ara h 3的序列與大豆球蛋白具有一定的相似性，分子結(jié)構(gòu)都具有較強(qiáng)的的穩(wěn)定性[12]。90%以上過敏患者的血清能識別Ara h l和Ara h 2，而Ara h 3在亞洲、歐洲及美洲只有50%過敏患者的血清能準(zhǔn)確識別。此外，只有極少數(shù)過敏患者的血清能識別Ara h 4～Ara h 17致敏蛋白，由于目前與之相關(guān)的研究相對較少，因此并沒有對其做進(jìn)一步的了解。需要強(qiáng)調(diào)的是，Ara h 4的特殊性已經(jīng)不像過去那么凸顯，其實質(zhì)上為Ara h 3.02[13]。Ara h 5蛋白廣泛存在于各類真核細(xì)胞內(nèi)，但研究表明這種蛋白在花生中的含量極低，難以大量獲得其純品[14]；Ara h 6和Ara h 7在花生中含量都相對較低，其中Ara h 6約占花生總蛋白的4.5%；分別將Ara h 6、Ara h 7與Ara h 2的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)二者序列的同源性高達(dá)59%和35%，還具備較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性[15-16]；Ara h 8在烘烤和胃消化等條件下很不穩(wěn)定，由此分析可知其熱穩(wěn)定性較差[17]；Ara h 9是一類具有較強(qiáng)熱穩(wěn)定性的非特異性脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[18]；Ara h 10、Ara h 11主要存在于花生的油脂中，因此被稱為油脂蛋白。Ara h 12的分子質(zhì)量有8、12、5.184 kDa 3種，同樣Ara h 13的分子質(zhì)量也有8、11、5.472 kDa 3種，均屬于防御素[19]。

圖1 花生主要致敏蛋白的空間結(jié)構(gòu)[20-22]

表1 花生致敏蛋白

2 致敏機(jī)制

食物過敏是特殊人群對某些食物或成分產(chǎn)生的不良免疫反應(yīng)，包括免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介導(dǎo)、非IgE介導(dǎo)或兩者的結(jié)合。然而花生過敏本身是IgE介導(dǎo)產(chǎn)生的超敏反應(yīng)，主要是I型超敏反應(yīng)機(jī)制。對于過敏個體而言，致敏原通過樹突狀細(xì)胞呈現(xiàn)給T細(xì)胞，異常激活Th2型效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)生IgE，與組織中的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞膜表面上的FcεRI受體結(jié)合[23-24]。當(dāng)再次接觸這種致敏原時發(fā)生脫顆粒反應(yīng)，激活肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞并釋放組織胺、白三烯、血小板活化因子等生物活性介質(zhì)，對效應(yīng)組織和器官造成影響，引起各種臨床過敏的癥狀，如節(jié)律紊亂，急性蕁麻疹，過敏性休克、死亡等[25-26]，IgE介異的過敏機(jī)制如圖2所示[27]。

圖2 IgE介導(dǎo)的過敏機(jī)制[27]

3 致敏蛋白的檢測方法

目前，主要從兩個層面進(jìn)行檢測：一是基于蛋白質(zhì)水平的檢測方法，如放射性免疫分析法(radio immuno assay，RIA)、免疫印跡(immunoblotting，IB)[28]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[29]、高效液相色譜分析法(HPLC)[30]以及質(zhì)譜分析法(MS)[31]。RIA和IB只能得到定性或半定量結(jié)果，而ELISA是定量方法，雖然ELISA精密度高、操作簡單，但目前僅用于常規(guī)食品分析。二是基于DNA水平的檢測方法，其中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[32]可用于特定DNA片段的擴(kuò)增，實時熒光定量(real-time polymerase chain reaction，RT PCR)[33]對待測樣品的特定DNA序列進(jìn)行分析即可獲得準(zhǔn)確的定量結(jié)果，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[34]即可通過肉眼觀察白色沉淀或綠色熒光就能判斷結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外鑒定。

由于食品中花生致敏蛋白種類及含量較多，復(fù)雜的加工過程可能會不同程度地影響DNA和蛋白質(zhì)[35]。因此，在實際應(yīng)用中，方法的選擇主要取決于所涉及的食品(特定抗體、DNA引物的可用性和可達(dá)到的檢測限)以及加工歷史。

3.1 基于蛋白質(zhì)水平的檢測方法

3.1.1 RIA

RIA用放射性同位素標(biāo)記花生致敏蛋白，同時與未標(biāo)記的花生致敏蛋白競爭結(jié)合一定量的特異性抗體，通過測量放射性同位素的含量間接計算花生致敏蛋白的量[36]。

DAVOUDZADEH等[37]通過Turbo-MPTM類型的免疫分析設(shè)備對包含花生致敏蛋白的十三類食源性致敏蛋白IgE進(jìn)行定量檢測，證明了Turbo-MPTM類型的免疫分析設(shè)備進(jìn)行定量檢測的可重復(fù)性，所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可通過Pharmacia Uni CAP系統(tǒng)進(jìn)行讀取，克服了傳統(tǒng)放射性免疫分析設(shè)備數(shù)據(jù)交互性能低的缺點。盡管放射性免疫分析法具備靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點，但也存在放射性污染的可能。因此在具體應(yīng)用中必須具有官方允許以及有效預(yù)防措施，以確保實驗的安全性和準(zhǔn)確性。

3.1.2 IB

IB是一種常用的蛋白質(zhì)免疫分析方法，先根據(jù)分子質(zhì)量分離相關(guān)蛋白質(zhì)，通過具體方式把分離的蛋白質(zhì)固定到相關(guān)的固相載體上，隨后將抗體當(dāng)作“探針”對相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，最終用標(biāo)記的二抗進(jìn)行“顯色”處理。

YAPO-CREZOIT等[38]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法，分析兩份花生種子的蛋白質(zhì)圖譜。在花生種子的浸提物中，檢測出致敏蛋白Ara h 1(63.5 kDa)、Ara h 2(17、20 kDa)和Ara h 3(25、36、40、44 kDa)的可見指紋，以及約36 kDa的Ara h 3致敏帶，有效證明花生致敏蛋白的存在。詹少德[39]以分離得到的高純度Ara h 2和溴化氫活化的Sepharose-4B柱材作為親和介質(zhì)材料，制備了從兔抗Ara h 2血清中分離純化抗Ara h 2多克隆抗體的親和層析柱，并采用免疫印跡技術(shù)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，純化后得到的天然Ara h 2純度高達(dá)90%，其多克隆抗體效價高，特異性強(qiáng)。雖然免疫印跡法具備分辨率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點，但在實驗中易出現(xiàn)雜帶或凝膠染色不勻的現(xiàn)象，影響實驗精準(zhǔn)度。因此，免疫印跡手段被廣泛運(yùn)用于相關(guān)致敏蛋白的定性分析。

3.1.3 ELISA

ELISA將酶促反應(yīng)的敏感性和抗原-抗體反應(yīng)的高特異性進(jìn)行結(jié)合，是一種常見的定量免疫學(xué)檢測手段[40]，可以分為夾心法、間接法和競爭法，常采用雙抗夾心法和競爭法對花生致敏蛋白進(jìn)行檢測。

PENG等[41]采用單抗為捕獲抗體和檢測抗體，并對檢測抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記，建立了Ara h 2夾心ELISA檢測方法，測得檢測限為0.02 ng/mL。MONTSERRAT等[42]創(chuàng)建了不同的ELISA方法對花生致敏蛋白展開檢測，實驗表明競爭ELISA敏感性優(yōu)于夾心ELISA。JANSSENDUIJGHUIJSEN等[43]采用雙單抗夾心ELISA法研究食用花生對受試者血清致敏蛋白的影響，在受試者的血清和體外檢測均檢測到Ara h 6，這為雙單抗夾心ELISA法檢測食品中的花生致敏蛋白提供了一定的參考方向。陳獻(xiàn)雄等[44]利用雙單克隆夾心法對Ara h l進(jìn)行檢測，測得檢測限為5 ng/mL，線性范圍為5～80 ng/mL，并同時能對10種含有花生成分的食品進(jìn)行檢測，得出的結(jié)果與其包裝上標(biāo)注的基本一致，因此可用于定性檢測食品中花生致敏蛋白。從免疫學(xué)檢測的方面來看，ELISA是一項最為重要且應(yīng)用廣泛的技術(shù)。由于利用較高活性的酶反應(yīng)以及抗原-抗體的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，在某種程度上來說能夠使反應(yīng)結(jié)果更為清晰，從而有效優(yōu)化靈敏度和針對性。然而，ELISA方法的不足在于其特異性取決于抗原的制備，這限制了其應(yīng)用范圍，有待改進(jìn)。

3.1.4 LC-MS/MS

LC-MS/MS將定性和分離兩類功能進(jìn)行了實際結(jié)合，能良好地進(jìn)行定量及定性分析；同時對樣品前處理進(jìn)行了具體簡化，能對相關(guān)樣品進(jìn)行迅速檢測且實際操作也比較簡易，在蛋白質(zhì)鑒定方面有著寬泛的使用前景。

PILOLLI等[45]開發(fā)了一種基于超聲波輔助溶劑萃取的尺寸排阻色譜柱的樣品處理程序，整合多維色譜分析系統(tǒng)，建立了一種簡單有效的分析方法，最后通過選擇反應(yīng)檢測掃描分析法從復(fù)雜底物中識別出花生致敏蛋白。此外，在線固相萃取的使用可以在傳統(tǒng)的反相分離之前，對部分目標(biāo)肽段進(jìn)行富集與純化，這為最終的選擇反應(yīng)檢測建立了一定的優(yōu)勢，在獲得較高靈敏度的同時仍能保持合理的運(yùn)行時間。DALY等[46]采用質(zhì)譜法對花生和杏仁ELISA試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)是杏仁ELISA檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性的主要原因。此方法成功彌補(bǔ)ELISA假陽性問題且更為可靠，具有實際應(yīng)用價值。洪宇偉等[47]采用LC-MS/MS對花生蛋白中的Ara h 2類致敏蛋白進(jìn)行檢測，測得檢測限為6.23 μg/g，回收率數(shù)值處于1.07～1.132。然而該方法對樣品、實際操作要求較高且儀器較為昂貴，所以在實際運(yùn)用一般都會受到限制。

3.2 基于DNA水平的檢測方法

3.2.1 PCR

PCR是DNA檢測中最常用的技術(shù)，其原理是在引物和TaqDNA聚合酶的作用下延伸DNA子鏈，使DNA模板實現(xiàn)指數(shù)級擴(kuò)增，再通過瓊脂凝膠電泳和熒光檢測技術(shù)對擴(kuò)增目標(biāo)片段進(jìn)行分析。

JAMES等[48]針對花生葉綠體tRNA基因中tml區(qū)域，通過PCR技術(shù)完成引物的設(shè)計，獲得642 bp的片段，由此將原料所含的花生致敏成分準(zhǔn)確檢出，并進(jìn)一步探究多重PCR對谷物致敏蛋白進(jìn)行檢測的應(yīng)用前景。HOUHOULA等[49]利用PCR技術(shù)檢測152份食品樣品，共檢出125份陽性花生樣品，占樣品總數(shù)的83%。雖然PCR也是對花生致敏蛋白進(jìn)行定量分析的檢測技術(shù)，能夠在食品致敏蛋白的相關(guān)檢驗中得到廣泛應(yīng)用，但是引物設(shè)計所受干擾因素較多，例如引物長度不夠會產(chǎn)生假陽性結(jié)果；而一旦DNA出現(xiàn)降解，檢測環(huán)節(jié)會存在較高的污染風(fēng)險，出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。因此，PCR在花生致敏蛋白的檢測與應(yīng)用中存在一定的局限性。

3.2.2 RT-PCR

RT-PCR是在定性PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的DNA定量技術(shù)，將具有相應(yīng)熒光作用的基團(tuán)添加到PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對檢測物質(zhì)進(jìn)行定量分析。常用的熒光標(biāo)記法主要有SYBR Green I類熒光染料以及TaqMan類探針。

陳家杰等[50]針對花生致敏蛋白Ara h 1基因的DNA序列，分別設(shè)計兩對特異性引物，建立SYBR Green I熒光實時定量PCR方法，對8種食品樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均與標(biāo)注的食物致敏蛋白內(nèi)容一致。蘭海鷗[51]建立了花生致敏蛋白基因(Ara h 1)的TaqMan探針快速檢測方法，主要針對特異性片段(Ara h 1自身DNA序列)進(jìn)行引物的實際設(shè)計，八類花生產(chǎn)品實際檢測結(jié)論和包裝標(biāo)注的實際成分完全一樣，表明其可以運(yùn)用到花生產(chǎn)品致敏蛋白Ara h 1的實際檢測環(huán)節(jié)。近年來，實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)的特異、快速、高效等優(yōu)點被科研工作者所熟知。但花生產(chǎn)品的部分致敏蛋白在加工環(huán)節(jié)有效去除后，基因檢測結(jié)果依舊呈現(xiàn)陽性，如何避免檢測結(jié)果的假陽性將成為該方法進(jìn)一步研究的方向[52]。

3.2.3 LAMP

PCR需要熱循環(huán)過程，通常整個擴(kuò)增過程需要1～2 h。近年來，為克服PCR方法在檢測時間上的局限性，人們開發(fā)了幾種等溫擴(kuò)增方法，其中LAMP最為常見。為實現(xiàn)高特異性，該法采用識別保守序列DNA的6個特異性片段的4條引物和1種鏈置換DNA聚合酶，在65 ℃左右使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)[53]。

SHEU等[54]利用兩組特異性LAMP引物分別針對花生核糖體DNA序列區(qū)的Ara h 1基因序列和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄序列1(ITS1)，60～65 ℃條件下進(jìn)行60 min的擴(kuò)增反應(yīng)，用于檢測加工食品或膳食中的花生成分。結(jié)果表明，LAMP對花生的檢測靈敏度高于傳統(tǒng)PCR，靶向ITS1的敏感性優(yōu)于靶向Ara h 1基因。YUAN等[55]將LAMP與微流控芯片集成，利用NeuRed染料建立了一種檢測花生致敏蛋白基因的比色方法。在LAMP反應(yīng)過程中，產(chǎn)生大量的氫離子，溶液逐漸變酸，使得顏色發(fā)生變化，反之則保持原來的顏色。但由于反應(yīng)體系中含有緩沖液，pH的變化不夠明顯。這也許可以解釋為什么建立的LAMP體系的靈敏度沒有PCR體系高。盡管如此，這種方法還是很方便的，可以用肉眼來區(qū)分結(jié)果。

4 總結(jié)與展望

由于食物過敏反應(yīng)在人群中的發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上升的態(tài)勢，食物過敏已成為全球頗受關(guān)注的食品安全問題。目前，預(yù)防食物過敏最有效的應(yīng)對方法是避免食用含致敏蛋白的食物，然而花生已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各類食品當(dāng)中，而我國強(qiáng)制要求食物標(biāo)簽標(biāo)注致敏成分的制度還不完善，因此這種方式難以實現(xiàn)。針對這種情況，加強(qiáng)對食物中致敏蛋白的檢測，對減少食物過敏事件的發(fā)生顯得至關(guān)重要。本文分別從蛋白質(zhì)和DNA水平對花生致敏蛋白的多種檢測方法進(jìn)行了綜述，并分析比較這些方法在花生致敏蛋白檢測中的優(yōu)缺點(圖3)。

圖3 花生致敏蛋白檢測技術(shù)基本原理及優(yōu)缺點

近年來，基于蛋白質(zhì)的檢測方法在花生致敏蛋白檢測中發(fā)揮了特別重要的作用，并展現(xiàn)出較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新材料、新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，食品致敏蛋白檢測方法越來越豐富。從傳統(tǒng)經(jīng)驗判斷到儀器檢測，從生化分析到分子鑒定，方法的準(zhǔn)確性、靈敏度和穩(wěn)定性也越來越高，蛋白質(zhì)組、代謝組、基因組等基于組學(xué)的檢測方法將成為檢測致敏蛋白的新一代技術(shù)手段。針對標(biāo)簽符合真?zhèn)舞b定、摻兌物檢測等核心問題，應(yīng)構(gòu)建從定性判別到精準(zhǔn)定量分析、從單物種單目標(biāo)識別到多物種多目標(biāo)多元高通量識別、從多組分到全組分分析的致敏蛋白檢測體系，深入對致敏蛋白檢測方法的研究。