郭穎慧，鄭世超，任易婕，程祥龍，霍勝楠*

1(山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南，250101)2(山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，山東 濟南，250101)

植物與人類有特別密切的關(guān)系，尤其是具有重要經(jīng)濟、文化、科學(xué)價值的植物，如優(yōu)質(zhì)作物食品、地方特色植物食品、藥食同源食品等，常有很高的食用價值。然而，由于檢測技術(shù)發(fā)展的局限性，人們常難以嚴(yán)格區(qū)分地方特色植物食品、高價值植物性食品，甚至出現(xiàn)在不知情的情況下誤食致敏性植物成分而對身體造成不同程度的損害，從而面臨著植物摻雜、摻假的高通量檢測評估、監(jiān)管執(zhí)法帶來嚴(yán)重的問題。

隨著人類基因組測序工作的完成和人類基因組草圖的公布，生物信息學(xué)的研究走向了一個高潮[1-2]。2003年，加拿大分類學(xué)家HEBERT首次提出DNA條形碼概念，是生物體一段公認(rèn)的能夠代表該物種的標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA片段[3-4]?；贒NA 條形碼技術(shù)，根據(jù)樣品類型選擇基因條形碼引物，擴增基因條碼序列并進行測序分析，通過數(shù)據(jù)庫比對確定目標(biāo)物種，成為物種鑒定的有效方法[5-7]。例如，HAMBCK等[8]采用DNA條形碼技術(shù)對波羅的海海岸周邊的蜘蛛攝食進行了篩查，白文明等[9]基于DNA條形碼技術(shù)鑒別有毒鵝膏菌屬物種。目前，國際上比較權(quán)威的核酸數(shù)據(jù)庫為GenBank[10]、EMBL[11]以及DDBJ[12]。葉綠體基因組中的RbcL[13-15]基因是植物源性分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的分子指標(biāo)之一。高等植物RbcL基因在結(jié)構(gòu)上和原核生物基因相似，由5′非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3′非編區(qū)3部分組成。5′非編碼區(qū)具有可以和葉綠體16S rRNA 3′端附近互補的S-D序到，3′非編碼區(qū)具反向重復(fù)序列，能形成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為轉(zhuǎn)錄終止信號[16]。目前，RbcL基因在很多植物鑒定及其多樣性的研究中獲得了較好的結(jié)果。姚丹丹等[17]利用RbcL基因序列分析馬尾藻屬遺傳進化關(guān)系，F(xiàn)AWLEY等[18]通過RbcL基因序列分析，揭示了藻類的廣泛多樣性，陳玉花等[19]建立了蜀葵花HPLC指紋圖譜及RbcL序列DNA條形碼分子鑒定方法，林曉霞等[20]基于RbcL序列對石斛屬植物親緣關(guān)系進行了研究。

為進一步解決食品中基于擴增子測序的植物摻假非定向篩查問題，本研究基于植物RbcL基因通用引物PCR擴增檢測和測序技術(shù)，通過反復(fù)實驗，開發(fā)了食品中基于擴增子測序的27種植物摻假非定向篩查方法。

1 材料與方法

1.1 植物RbcL基因通用引物序列

由于二代測序平臺測序長度的限制，以及考慮大部分食品為深加工產(chǎn)品，導(dǎo)致基因組發(fā)生一定程度的降解，小片段條形碼更加適用。因此本研究采用430 bp 左右的RbcL[21]片段作為條形碼，引物序列如下：

5′端引物：5′-AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3′

3′端引物：5′-TCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3′

1.2 試劑配制

1.2.1 PBS緩沖液

800 mL水中加入8.0 g氯化鈉，0.2 g氯化鉀，2.98 g磷酸氫二鈉和0.22 g磷酸二氫鈉，充分溶解后用鹽酸調(diào)pH至7.4，加水定容至1 000 mL，在103.4 kPa，121 ℃條件下，滅菌15 min后使用。

1.2.2 裂解緩沖液Ⅰ

500 mL水中加人117.0 g氯化鈉、20 g十六烷基三甲基溴化銨，充分溶解后，加入200 mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液，100 mL乙二胺四乙酸二鈉溶液，加水定容至1 000 mL，在103.4 kPa，121 ℃條件下，滅菌15 min后使用。

1.2.3 裂解緩沖液Ⅱ

800 mL水中加入50 g十二烷基肌氨酸鈉，充分溶解后，加水定容至1 000 mL，在103.4 kPa、121 ℃條件下，滅菌15 min后使用。

1.2.4 3 mol/L乙酸鉀溶液(pH 5.2)

60 mL水中加入29.4 g乙酸鉀，充分溶解，用冰乙酸調(diào)pH至5.2，加水定容至100 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計，美國Thermo公司；ProFlex PCR儀，美國ABI公司；5424R小型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；DYCP-31A電泳儀，北京六一儀器廠；EC3Darkroom凝膠成像系統(tǒng)，美國Spring Scientific公司。

1.4 樣品制備及基因組DNA提取

1.4.1 獨立樣品的制備及DNA提取

稱取0.5 g待測樣品，充分研磨后轉(zhuǎn)移至離心管中。加入1.0 mL裂解緩沖液I和0.4 mL裂解緩沖液Ⅱ，充分混勻，65 ℃溫浴40 min，20 ℃、12 000×g離心15 min，吸取上清液到另一新的離心管中。加入等體積平衡酚-氯仿溶液，輕輕混勻，20 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清液到另一新的離心管中。加入等體積氯仿，輕緩混勻，20 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清液到另一新的離心管中。加入0.6倍體積異丙醇、0.1倍體積的乙酸鉀溶液，輕輕顛倒混勻，-20 ℃靜置2 h以上，20 000×g離心10 min，棄上清液。加入0.5 mL 1.0 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，顛倒混合。12 000×g離心10 min，棄上清液。干燥DNA沉淀。加100 μL水或TE緩沖液溶解DNA。DNA的濃度和質(zhì)量采用紫外分光光度法測定。

1.4.2 混合樣品的制備及DNA提取

將1.4.1提取的DNA選擇4～6個物種，將其按照等比例濃度進行混合形成混合樣本A1～A4，具體成分見表1。

表1 混合植物源性樣本成分

1.5 PCR擴增與電泳

反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中10×PCR緩沖液5 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 μmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶(2.5U)0.2 μL，DNA模板(10～100 ng/μL)2 μL，用滅菌去離子水補足至總體積25 μL?？墒褂孟嗤Ч纳唐坊疍NA聚合酶預(yù)混液進行PCR擴增。

反應(yīng)參數(shù)：95 ℃(5 min)→95 ℃(30 s)→56 ℃(30 s)→72 ℃(30 s)，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4℃保存。

電泳采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

1.6 測序及分析

單一物種樣品檢測時，將PCR擴增產(chǎn)物進行Sanger法DNA測序?；旌衔锓N樣品檢測時，將PCR擴增產(chǎn)物進行二代測序分析。本研究測序由生工生物工程(上海)股份有限公司測序平臺完成。

采用Cutadapt(v1.18)、PRINSEQ(0.20.4)、Usearch(11.0.667)軟件對測序原始數(shù)據(jù)進行優(yōu)化處理；采用Usearch(11.0.667)、gplots(3.0.1.1)、RDPclassifier(2.12)、ETE3(3.1.1)軟件對所有序列進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分并進行生物信息統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物通用性、特異性驗證

以市售紅小豆、大豆、綠豆、馬鈴薯、桃核、芝麻等27種蔬果作物的基因組DNA和10種動物基因組DNA為模板，利用RbcL通用引物進行PCR擴增后凝膠電泳檢測(圖1)，驗證引物的通用適用性與植物特異性。

M-Marker(DL 2000)；1～27-以紅小豆、大豆、綠豆、紅薯、馬鈴薯、木薯、薏米、小麥、玉米、小米、水稻、杏、腰果、榛子、芝麻、巴旦木、核桃、桃、香蕉、梨、小番茄、南瓜、胡蘿卜、蘋果、花生、開心果、蕓豆基因組為模板的電泳結(jié)果；28～37-以豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、馬、驢、貓、狗基因組為模板的電泳結(jié)果；38-陰性對照

實驗結(jié)果表明，以27種植物基因組DNA為模板，利用通用引物進行PCR擴增，均可獲得430 bp左右大小的條帶，而以10種動物基因組DNA為模板，利用通用引物進行PCR擴增，均未擴增出目標(biāo)片段。通用引物對該27種植物成分檢測特異性、通用性較好。PCR產(chǎn)物經(jīng)過Sanger法DNA測序后，將得到的堿基序列通過DNAMAN軟件進行比對(圖2)，由圖2可見，經(jīng)過本實驗涉及的引物擴增，27種不同物種的基因序列存在不同，可以利用數(shù)據(jù)庫進行比對。經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)序列比對，綜合考慮Score值、Coverage值、Evalue值，相似度與Genbank序列號見表2，相似度均>99%。通常要求同種植物序列的相似度≥99%[22]。因此，植物通用引物RbcL可以有效地將實驗所涉及的27種不同物種的植物區(qū)分開來。

圖2 27種植物測序堿基序列比對

表2 PCR產(chǎn)物測序NCBI比對結(jié)果

2.2 檢測方法靈敏度驗證

10倍系列梯度稀釋目標(biāo)植物源性成分基因組DNA，PCR反應(yīng)體系內(nèi)分別加入100、10、1、0.1 ng/μL 基因組DNA，進行PCR擴增，圖3為玉米基因組DNA 10倍系列梯度稀釋PCR擴增后電泳檢測圖。

1-100 ng/μL基因組DNA；2-10 ng/μL基因組DNA；3-1 ng/μL基因組DNA；4-0.1 ng/μL基因組DNA；M-Marker(DL 500)

實驗結(jié)果表明，隨著模板DNA濃度的遞減，PCR擴增條帶呈現(xiàn)梯度變?nèi)踮厔?。?dāng)基因組模板DNA質(zhì)量濃度為0.1 ng/μL時，擴增條帶良好?；厥针娪緱l帶進行測序，結(jié)果見表3。當(dāng)基因組模板DNA質(zhì)量濃度為0.1 ng/μL時，回收失敗，因此該方法的檢測靈敏度為1 ng/μL。

表3 玉米基因組梯度稀釋PCR產(chǎn)物測序NCBI比對結(jié)果

2.3 混合植物源性成分樣本分析

2.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

4個樣本提取基因組DNA，PCR擴增后將擴增產(chǎn)物進行二代測序，對測序原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)量和測序質(zhì)量的統(tǒng)計，A1、A2、A32、A4樣本的數(shù)據(jù)產(chǎn)出的有效序列條數(shù)分別為69 693、68 267、73 099、97 713(表4)。

表4 測序數(shù)據(jù)信息

2.3.2 OTU聚類分析及物種注釋

OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系，屬，種、分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。通過聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多OTU。通常對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析[23]。對4個樣本進行OTU聚類分析，共產(chǎn)生13個OTU，4個樣本OTU中序列數(shù)統(tǒng)計以及OTU對應(yīng)的物種注釋信息見表5，表中僅展示了豐度前5的OTU。

表5 樣本OTU中序列數(shù)統(tǒng)計及物種注釋

為得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，利用RDPclassifier進行物種分類注釋。根據(jù)每個樣本的分類學(xué)比對結(jié)果，選出優(yōu)勢物種的分類，從整個分類系統(tǒng)上了解測序的樣本中優(yōu)勢物種和豐度差異。使用python的ete3 package繪制每個樣本分類系統(tǒng)組成樹狀圖。4個樣本在不同分類水平下(域，門，綱，目，科，屬，種)的物種種類數(shù)目統(tǒng)計如圖4所示，種水平下物種類別與樣本信息基本一致。

a-A1分類系統(tǒng)組成樹；b-A2分類系統(tǒng)組成樹；c-A3分類系統(tǒng)組成樹；d-A4分類系統(tǒng)組成樹

3 結(jié)論

高通量測序使核酸測序成本大幅度下降，從而推動了生命科學(xué)各學(xué)科的發(fā)展[23]。檢測植物摻假問題的方法中，分子生物學(xué)方法是較為重要的手段，包括酶聯(lián)免疫技術(shù)、DNA條形碼技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)[24]等。酶聯(lián)免疫技術(shù)具有檢測速度快、費用低廉、儀器簡單易攜等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場檢測，但只是檢測的輔助手段，特異性和靈敏性有待提高。實時熒光定量PCR技術(shù)特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、全封閉反應(yīng)、減少了產(chǎn)物的污染，同時也存在無法高通量篩查樣本的問題，面對未知成分樣本，檢測過程復(fù)雜。本研究基于擴增子測序檢測手段，發(fā)展針對食品中常見27種植物源性成分的高通量篩查技術(shù)，通過反復(fù)實驗和大量實際樣品驗證，利用一代測序分析技術(shù)、二代測序分析技術(shù)對單一物種食品、混合物種食品中常見植物源性進行高通量、非定向篩查，從而解決植物源性食品摻假快速檢測的問題。然而，本實驗之外的其他物種的RbcL基因序列在該引物的擴增區(qū)域有無完全相同的現(xiàn)象，是否會導(dǎo)致難以區(qū)分某兩種或幾種物種還有待驗證，同時為了規(guī)范植物食品樣本信息，有效抓取海量數(shù)據(jù)，需要不斷完善參考序列數(shù)據(jù)庫的質(zhì)量和完整性，為宏基因組技術(shù)在植物源性成分食品的摻假非定向篩查研究中廣泛應(yīng)用提供更加堅實的基礎(chǔ)。