葉倩，唐雪妹，高毓文，黃健祥*

1(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測技術(shù)研究所, 廣東 廣州，510640)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(廣州), 廣東 廣州，510640)3(廣東農(nóng)科監(jiān)測科技有限公司，廣東 廣州，510640)

赤霉素(gibberellin，GAs)作為植物中一類重要的生長調(diào)節(jié)劑，在自然界廣泛分布。赤霉素在植物生長過程中主要參與種子萌發(fā)，幼苗生長發(fā)育、果實成熟發(fā)育等重要的生理過程，其中以GA3最為活躍[1-2]。赤霉素通過促進(jìn)細(xì)胞分裂伸長來調(diào)控植物株高、器官大小、葉面積以及根系發(fā)育；也有報道發(fā)現(xiàn)赤霉素對株高、單顆植株葉片數(shù)、新生枝鮮重等都有重要的影響[3-9]。近年來通過田間調(diào)研發(fā)現(xiàn)，為追求產(chǎn)量的增加，莧菜、菠菜等葉類蔬菜在種植過程中會外源施用赤霉素。因此，外源赤霉素的使用是否會有殘留；以及外源赤霉素的施用是否會對人體健康產(chǎn)生危害也越來越多地引起關(guān)注。目前GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標(biāo)準(zhǔn)中尚未制定赤霉素在蔬菜中的最大殘留限量。日本肯定列表中對赤霉素在蔬菜中殘留限量定為0.2 mg/kg[10]。據(jù)文獻(xiàn)報道，赤霉素主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法[11-17]，高效液相色譜法[18-20]等方法檢測。這些分析方法的應(yīng)用范圍包括茄果類蔬菜、葡萄等水果以及豆芽樣品。采用的樣品處理方法常為有機(jī)溶劑提取結(jié)合固相萃取凈化等方法，存在操作繁瑣、消耗時間長等不足。莧菜、菠菜等葉類蔬菜的基質(zhì)成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾較大，增加了分析的難度。本文通過優(yōu)化提取溶劑、提取時間、吸附劑、鹽的種類和稀釋倍數(shù)等實驗條件，建立了基于QuEChERS與LC-MS/MS相結(jié)合的莧菜、菠菜中赤霉素的殘留分析方法。并將此方法應(yīng)用于市場上流通的莧菜、菠菜樣品的分析檢測。該方法具有快速、簡便、準(zhǔn)確等特點，滿足莧菜、菠菜中農(nóng)藥殘留分析的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

8050型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，日本島津公司；HeidolphMul tiReax渦旋儀，德國Heidolph公司；高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Milli Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

乙腈和甲醇(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(純度99%)，美國Sigma公司；C18、石墨化碳黑(GCB)、Florisil凈化劑，天津博納艾杰爾公司；PSA凈化劑，美國Agilent公司；乙酸、無水硫酸鎂、無水醋酸鈉(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；0.22 μm尼龍66微孔過濾膜，天津津騰實驗設(shè)備有限公司；赤霉素1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液(純度≥99.0%)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)；莧菜、菠菜，樣品購自本地市場。

1.2 樣品前處理

稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中，加入20.00 mL含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇溶液，加入1.00 g無水硫酸鎂和0.20 g無水醋酸鈉，渦旋振蕩2 min；后以4 500 r/min 離心5 min；取上清液用0.22 μm尼龍66濾膜過濾，待測定。

1.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：島津Shim-pack XR-ODSIII柱(2.0 mm×75 mm, 1.6 μm)。流動相A：0.1%甲酸水(體積分?jǐn)?shù))；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～2 min, 10%B；2～5 min, 10%B～95%B；5～7 min, 95%B；7.1 min, 10%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。霧化氣：3 L/min；加熱氣：10 L/min；干燥氣：10 L/min；離子源接口溫度：300 ℃；脫溶劑溫度：250 ℃；加熱塊：400 ℃。采用ESI離子源，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(multi-reaction monitoring，MRM)檢測。赤霉素的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。

表1 赤霉素質(zhì)譜檢測參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取1 000 mg/L赤霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇配制成100 mg/L的儲備液，-20 ℃保存。使用不含待測化合物的莧菜、菠菜空白基質(zhì)將赤霉素分別配制成0.001、0.005、0.010、0.050、0.10、0.50、1.00 mg/L系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 正確度和精密度

稱取經(jīng)測定不含赤霉素的空白莧菜、菠菜樣品5.00 g，分別對應(yīng)添加0.010、0.10、0.50 mg/kg 3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。渦旋混勻后放置過夜(約12 h)，按照1.2節(jié)進(jìn)行前處理。每個添加濃度重復(fù)5次，考察方法回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，用以評價方法的正確度和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)赤霉素的性質(zhì)，以不含待測化合物的莧菜為基質(zhì)，對比乙腈、含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈、含2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈、甲醇、含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇和含2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇溶液的提取效果。結(jié)果如圖1所示，采用乙腈、含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈、含2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的乙腈為提取溶劑的回收率為2%～65%；使用甲醇、含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇和含2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇溶液為提取溶劑的回收率為70%～72%；甲醇及酸化甲醇的提取效果整體效果優(yōu)于乙腈及酸化乙腈溶劑的提取效果，且含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇為提取溶劑時赤霉素的回收率最好達(dá)72%，滿足NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》中農(nóng)藥定量分析要求。本試驗最終采用含1%(體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇溶液為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對赤霉素回收率的影響

2.2 吸附劑的優(yōu)化

試驗對比了PSA、C18、GCB、Florisil、GCB+PSA、MgSO4+PSA+C18的凈化效果，以及未使用吸附劑提取液直接檢測的結(jié)果。結(jié)果如圖2所示，單一使用PSA、C18、GCB或Florisil吸附劑時，赤霉素的回收率為68%～74%；使用GCB+PSA、MgSO4+PSA+C18時赤霉素的回收率為52%～60%；而未使用吸附劑的提取液直接進(jìn)行檢測時赤霉素的回收率最高，為79%，滿足NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》中農(nóng)藥定量分析要求。本試驗最終采用提取液過0.22 μm尼龍66有機(jī)濾膜后直接檢測的條件。

圖2 吸附劑對赤霉素回收率的影響

2.3 提取時間的優(yōu)化

試驗考察了提取時間分別為1、2、3、4、5 min對方法回收率的影響。結(jié)果如圖3所示，前1、2 min隨著提取時間的延長，回收率也增加，分別為83%和86%；隨著提取時間繼續(xù)增加為3、4、5 min，回收率分別為79%、78%以及83%，其并未隨提取時間的增而繼續(xù)增加，反而呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢。因此提取2 min時，赤霉素的回收率最高，達(dá)85%以上且滿足NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》中農(nóng)藥定量分析要求。綜上所述，本研究最終采用2 min作為提取時間。

圖3 提取時間對赤霉素回收率的影響

試驗優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，提取溶劑中加入鹽后，會放出大量的熱，且前2 min熱量相對較高，而隨著提取時間的增加釋放的熱量逐漸趨于減少，且在5 min時提取液的溫度明顯比提取1～2 min時低。因此結(jié)合提取時間與回收率的變化情況，分析原因是否是提取液溫度的變化影響了赤霉素的提取效果，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步考證。

2.4 稀釋倍數(shù)和鹽的優(yōu)化

在提取溶劑優(yōu)化試驗中發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈在溶解鹽的能力上存在明顯的差別。在鹽的種類、質(zhì)量等均相同的條件下，甲醇對鹽的溶解能力相對較差，更容易析出。試驗中采用稀釋2、3、4倍提取溶劑和4 g MgSO4+1 g NaAC、2 g MgSO4+1 g NaCl、1 g MgSO4+0.5 g NaAC和1 g MgSO4+0.2 g NaAC的組合來優(yōu)化提取溶劑以及鹽的種類、用量。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)使用4倍提取液進(jìn)行提取時，4種鹽的組合對赤霉素的提取效率最好，都可達(dá)到76%以上。但是在多批次進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)，4 g MgSO4+1 g NaAC、2 g MgSO4+1 g NaCl 和1 g MgSO4+0.5 g NaAC的組合條件下離子源會析出大量的鹽，嚴(yán)重影響了儀器的正常運(yùn)行，同時色譜進(jìn)樣瓶中的分析樣品隨時間延長也會有部分鹽析出，增加了損壞儀器的風(fēng)險。而1 g MgSO4+0.2 g NaAC經(jīng)過多次驗證，重復(fù)進(jìn)樣離子源并沒有鹽析出，同時色譜進(jìn)樣瓶中的分析樣品隨時間的變化未見鹽析出。綜合上述試驗結(jié)果，本試驗最終采用4倍提取液和1 g MgSO4+0.2 g NaAC鹽進(jìn)行后續(xù)樣品的分析。

圖4 鹽對赤霉素回收率的影響

2.5 線性方程、檢出限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantity, LOQ)

用1.2節(jié)的方法對空白莧菜、菠菜進(jìn)行前處理，得到的2種空白基質(zhì)用以配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。以待測化合物濃度為橫坐標(biāo)(x)，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)獲得赤霉素的工作曲線。赤霉素在2種基質(zhì)中的線性方程、LOD(信噪比S/N=3)和LOQ見表2，赤霉素的LOQ為添加的最低濃度0.010 mg/kg，滿足NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》中關(guān)于莧菜和菠菜中赤霉素殘留分析的要求。

2.6 方法回收率和精密度

按照1.5節(jié)所述進(jìn)行添加回收試驗。不同基質(zhì)中赤霉素的回收率見表2。結(jié)果表明，赤霉素在莧菜、菠菜中的回收率為82%～91%，RSD為2%～6%，方法準(zhǔn)確度和精密度均符合NY/T 788—2018《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》中關(guān)于殘留分析的要求。赤霉素在莧菜、菠菜空白樣品中加標(biāo)(0.05 mg/kg)的色譜圖見圖5。

a-莧菜;b-菠菜

2.7 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

農(nóng)藥殘留檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)現(xiàn)象是影響定量準(zhǔn)確度的關(guān)鍵因素之一，會對某些待測物的準(zhǔn)確定量與定性造成影響，因此建立分析方法之時，必須要對待測物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估。本研究以公式(1)對基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects，ME)進(jìn)行了評價[21]：

(1)

當(dāng)ME>1時，則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME<1時，則為基質(zhì)減弱效應(yīng)；ME越接近1，表明基質(zhì)效應(yīng)越小。莧菜和菠菜作為植物源類食品中常見的葉類蔬菜，基質(zhì)效應(yīng)更是不可避免。采用上述基質(zhì)效應(yīng)評價方法對莧菜和菠菜中赤霉素的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，結(jié)果顯示(表2)，赤霉素在莧菜中的基質(zhì)效應(yīng)為1.59；在菠菜中的基質(zhì)效應(yīng)為1.69，二者相近且均為較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(ME≥1.59)。因此，為保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗選擇基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，用于對試驗中所有檢測結(jié)果的定量。

表2 赤霉素在莧菜和菠菜中的線性方程、添加回收率、RSD、基質(zhì)效應(yīng)、LOD和LOQ(n=5)

2.8 實際樣品分析

分析來自本地市場的莧菜131個樣品，其中32個莧菜樣品中檢出赤霉素，最大值0.006 mg/kg，均低于LOQ。分析來自本地市場的菠菜331個樣品，其中21個菠菜樣品中檢出赤霉素(≥LOQ)，檢出最大值0.16 mg/kg。詳見表3。

表3 市場莧菜、菠菜樣品中赤霉素的殘留情況

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化提取溶劑、提取時間、吸附劑類型、鹽的種類和稀釋倍數(shù)，建立了QuEChERS-LC-MS/MS快速測定莧菜和菠菜中赤霉素的分析方法。QuEChERS法易于操作、時間成本短；LC-MS/MS法除選擇性、靈敏度等優(yōu)勢外，同時兼具高通量的特點。本文結(jié)合了2種技術(shù)的優(yōu)點，能有效降低蔬菜基質(zhì)干擾，同時使該方法在實際應(yīng)用中更具有可操作性。試驗分析結(jié)果表明，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度等滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求，適用于莧菜、菠菜等葉菜中赤霉素殘留的快速分析。同時對市場131個莧菜樣品、331個樣品菠菜進(jìn)行分析檢測，赤霉素檢出最大值為0.16 mg/kg，以日本肯定列表中對赤霉素在蔬菜中殘留限量判定,無超標(biāo)樣品[11]。