周明輝，曾慧云，王夢倩，張雁，王占軍

(合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥，230061)

色素在食品、日用化工、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)得到廣泛的應(yīng)用，而化學(xué)合成的色素具有一定的毒性、致癌、致畸性，因此以天然色素取代化學(xué)合成色素已成為食品工業(yè)的發(fā)展趨勢[1-2]。天然色素主要來自動(dòng)植物、微生物的組織或代謝產(chǎn)物，大多無副作用，安全性高，很多天然色素具有預(yù)防治療疾病、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化等功能，應(yīng)用價(jià)值較高[3]。而微生物天然色素，具有來源廣、價(jià)格低廉，成本較低、受環(huán)境因素影響小等諸多優(yōu)點(diǎn)，且能夠避免動(dòng)植物天然色素的許多缺陷，具有較大的發(fā)展?jié)摿4]。大部分細(xì)菌、真菌、放線菌都能夠產(chǎn)生天然色素，但很多菌株色素產(chǎn)量低，有的菌株同時(shí)也產(chǎn)生毒素，純化色素比較困難，因此從環(huán)境中篩選出高效、安全的產(chǎn)色素菌株尤為重要[5]。研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌菌源容易獲取，菌絲發(fā)達(dá)，繁殖迅速，在食品中應(yīng)用較多，如紅曲霉產(chǎn)生的紅曲色素[6]、三孢布拉霉產(chǎn)生的番茄紅素和β-胡蘿卜素等[7]。絲狀真菌色素具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣、生物活性顯著、生產(chǎn)方便、消炎抑菌并往往兼有營養(yǎng)保健功能等優(yōu)點(diǎn)，因此，絲狀真菌有望成為食品色素的可靠來源[8]。

本實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境中分離出1株焦曲霉，能產(chǎn)生豐富的棕紅色色素，目前對該色素的研究未見報(bào)道，因此，本課題對該色素的組成特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及產(chǎn)色素的條件進(jìn)行深入研究，以期開發(fā)出一種新型的天然的可食用的微生物源色素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

焦曲霉：由合肥師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離純化鑒定，上海生工有限公司分子測序。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬丁氏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 12.0，蛋白胨4.5，KH2PO41.2，MgSO4·7H2O 0.6，瓊脂18～25，pH自然，0.1 MPa，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑藥品

所用試劑藥品均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司；應(yīng)用于GC-MS的溶劑為色譜級甲醇，美國TEDIA公司；HPD600大孔樹脂、硅膠(200～300目)、中性氧化鋁(100～200目),青島海洋化工有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

BXM-50VE高壓蒸汽滅菌器、BSD-YX-2000立式搖床，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Allegra 64r高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼儀器設(shè)備有限公司；LGj-10真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技有限公司；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司；Nicolet 380紅外光譜儀，美國Themo Fisher科技有限公司；7890B-5977A GC-MS，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 焦曲霉色素粗提物的制備

無菌水沖洗焦曲霉保藏斜面，制成×106個(gè)/mL孢子懸液，吸取1 mL孢子懸液加入到150 mL馬丁氏培養(yǎng)基中，置28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)96 h。對焦曲霉發(fā)酵液進(jìn)行10 000 r/min離心10 min，提取色素上清液，置冷凍干燥機(jī)的金屬圓盤，并用扎孔的透明薄膜封口，置于-20 ℃預(yù)凍12 h，繼而在真空冷凍干燥機(jī)中干燥12 h，后加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇浸泡24 h，10 000 r/min離心10 min，去除蛋白與多糖，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥與真空冷凍干燥，獲取色素的粗提物。

1.2.2 焦曲霉色素的分離純化

稱取0.1 g色素粗提物，溶解到10 mL蒸餾水中，作為色素點(diǎn)樣樣品。分別配制V(氯仿)∶V(甲醇)=50∶50、V(水)∶V(甲醇)∶V(乙醇)= 20∶30∶50、V(水)∶V(乙醇)=40∶60、V(石油醚)∶V(氯仿)=40∶60、V(水)∶V(醋酸)∶V(乙醇)=20∶30∶50作為展開劑系統(tǒng)，選取購置的硅膠板作為固相載體，進(jìn)行薄層層析，對色素進(jìn)行分離，判斷色素的組成特性。利用毛細(xì)管在距離硅膠板底部1 cm進(jìn)行5次平行點(diǎn)樣，置于不同展開劑的層析缸中，展開劑不能沒過硅膠點(diǎn)樣線，當(dāng)展開劑前沿移至距離薄層板上端處，停止展開，按照公式(1)計(jì)算比移系數(shù)(retardation factor，Rf)。根據(jù)薄層層析結(jié)果，選取合適的展開劑作為淋洗劑進(jìn)行柱層析，色素水溶液為樣品，以大孔樹脂、中性氧化鋁、硅膠作為吸附材料進(jìn)行柱層析純化色素，將分離純化較好的層析液進(jìn)行干燥，獲取色素的精提物。稱取一定量的色素精提物粉末溶解在色譜級甲醇中，并高速離心，獲取色素濾液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(1)

1.2.3 色素的紫外可見與紅外掃描

將色素濾液在200～800 nm進(jìn)行紫外可見掃描，以甲醇作為空白對照，獲取該色素的最大吸收峰；稱取0.1 g色素精提物粉末，按質(zhì)量比1∶100與KBr粉末混合均勻壓片，紅外光譜儀在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析，獲取焦曲霉色素重要化學(xué)基團(tuán)的信息。

1.2.4 色素GC-MS

將色素濾液，用于GC-MS分析。采用Trace GC Ultra和ISQ Ⅱ MS對色素進(jìn)行分析，GC-MS柱為TG-35 ms 的石英毛細(xì)管柱，柱溫設(shè)定從50 ℃程序升溫至300 ℃(10 ℃/min)，載氣(氦氣)流速為1 mL/min；注射器和檢測器溫度為280 ℃，質(zhì)譜分析在EI模式、70 eV 條件下進(jìn)行滿掃。

1.2.5 碳氮源對焦曲霉色素產(chǎn)量的影響

以馬丁氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，按表1選擇同量的不同種類的碳氮源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每種組合培養(yǎng)基均取150 mL，接種1 mL的×106個(gè)/mL濃度的焦曲霉孢子懸液，于28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清液在色素最大吸收峰下檢測其OD值，以未接種的相應(yīng)培養(yǎng)基作為對照，每種組合設(shè)置3個(gè)平行，以獲取最適碳氮源。

表1 碳氮源試驗(yàn)

1.2.6 產(chǎn)色素條件的優(yōu)化

結(jié)合1.2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以馬丁氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用均勻設(shè)計(jì)法對最適碳氮源、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、孢子懸液接種量、發(fā)酵時(shí)間7個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以獲取最適產(chǎn)色素條件，提高色素產(chǎn)量，每批次試驗(yàn)配制150 mL培養(yǎng)基，做3次平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 焦曲霉色素粗提物

焦曲霉經(jīng)過96 h發(fā)酵培養(yǎng)，產(chǎn)生了豐富的棕紅色色素，色素經(jīng)焦曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)生并分泌到胞外，進(jìn)入發(fā)酵液(圖1-a)，色素水溶性較高；發(fā)酵液經(jīng)過離心，得到棕紅色上清液(圖1-b)，經(jīng)真空冷凍干燥處理獲取了色素粗提粉末(圖1-c)，該色素粉末在空氣中吸濕性較強(qiáng)，易潮解。

a-色素發(fā)酵液；b-色素水溶液；c-色素粗提物

2.2 焦曲霉色素的薄層層析

在薄層層析實(shí)驗(yàn)中，不同的展開劑對焦曲霉色素的分離情況不同。

氯仿∶甲醇分離系統(tǒng)：色素向上輕微移動(dòng)，Rf= 0.14±0.025，難以分離，有拖尾現(xiàn)象，分離效果不佳(圖2-a)；甲醇∶乙醇分離系統(tǒng)：色素向上移動(dòng)較快，分離較好，Rf= 0.7±0.008(圖2-b)；水∶乙醇分離系統(tǒng)：色素向上快速移動(dòng)，分離較好，Rf= 0.72±0.008(圖2-c);石油醚∶氯仿分離系統(tǒng)：色素基本無移動(dòng)，分離效果較差，Rf= 0(圖2-d)；水∶醋酸∶乙醇分離系統(tǒng)：色素向上快速移動(dòng)，分離較好，Rf=0.71±0.004(圖2-e)。

圖2結(jié)果說明該色素在極性較強(qiáng)的展開劑中，移動(dòng)速度較快，分離效果較好，能被甲醇、乙醇、醋酸、水等極性較強(qiáng)物質(zhì)拖動(dòng)，而極性較弱的如氯仿、石油醚不能將色素拖動(dòng)，其中水∶乙醇分離系統(tǒng)對色素的分離效果最好，性價(jià)比較高，可選擇該展開系統(tǒng)作為后續(xù)的柱層析淋洗劑。不同的展開劑系統(tǒng)對色素進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)只有一種色素斑點(diǎn)，且顏色單一，推測焦曲霉色素是一種單一色素。

a-氯仿∶甲醇分離系統(tǒng)；b-水∶甲醇∶乙醇分離系統(tǒng)；c-水∶乙醇分離系統(tǒng)；d-石油醚∶氯仿分離系統(tǒng)；e-水∶醋酸∶乙醇分離系統(tǒng)

2.3 焦曲霉色素的柱層析

以色素粗提物的水溶液作為柱層析樣品，分別選取大孔樹脂、中性氧化鋁、硅膠作為吸附材料，以薄層層析性價(jià)比最高的60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇展開劑作為淋洗劑，采用干法裝柱，進(jìn)行柱層析，進(jìn)一步對色素進(jìn)行分離純化，并收集層析液。由于大孔樹脂的吸附力較強(qiáng)，和焦曲霉色素結(jié)合牢固，淋洗劑無法分離色素(圖3-a)；中性氧化鋁與該色素的結(jié)合力較弱，輕易被水乙醇系統(tǒng)淋洗下來，但該色素整體溶解在淋洗系統(tǒng)中，達(dá)不到分離純化的目的(圖3-b)；而該色素在硅膠結(jié)合適中，淋洗劑洗脫效果較好，能形成唯一單一的色素環(huán)，說明該色素為單色素，與色素薄層層析結(jié)果一致(圖3-c)。收集硅膠柱層析的色素環(huán)流出液，對其進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)與真空冷凍干燥，并溶解于色譜級甲醇中，高速離心超濾獲取色素濾液(圖3-d)，由于色素在甲醇中的溶解度較低，相比色素水溶液，色澤明顯下降。

a-大孔樹脂柱層析；b-硅膠柱層析；c-氧化鋁柱層析；d-色素濾液

2.4 色素紫外可見掃描

a-焦曲霉色素紫外可見掃描；b-焦曲霉色素紅外掃描

2.5 焦曲霉色素的GC-MS檢測

對焦曲霉色素濾液進(jìn)行GC-MS檢測，從50～300 ℃ 連續(xù)性升溫氣相檢測，重復(fù)3次樣品，主要出現(xiàn)了2個(gè)主要的峰型且峰型一致，峰型較好，說明檢測出2種主要物質(zhì)，保留時(shí)間分別為18.549 min與21.565 min(圖5)。

圖5 焦曲霉色素氣相色譜

通過質(zhì)譜檢測，保留時(shí)間18.549與21.565 min分子質(zhì)量分別為154 Da與386 Da(圖6-a)，與NITS圖庫的比對，分子質(zhì)量154 Da的化學(xué)結(jié)構(gòu)推測為吡咯并[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮六氫匹配度為50.2%，分子質(zhì)量為386 Da的化學(xué)結(jié)構(gòu)為二蒽酮類，匹配度達(dá)到98%(圖6-b)，圖庫給出的結(jié)構(gòu)與紅外檢測的結(jié)果一致。

a-色素質(zhì)譜；b-質(zhì)譜解析

2.6 不同碳氮源對焦曲霉產(chǎn)色素的影響

選擇不同的碳氮源作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h，在298 nm 處檢測OD值，以判斷色素合成的最適碳氮源。不同碳氮源對焦曲霉色素產(chǎn)量的影響差異較大，其中葡萄糖與蛋白胨的組合，色素產(chǎn)量最高(圖7)，因此選擇葡萄糖與蛋白胨為最適碳氮源作進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖7 碳氮源試驗(yàn)

2.7 產(chǎn)色素條件的優(yōu)化

表2 均勻設(shè)計(jì)與響應(yīng)因子

并對試驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)因素進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與回歸模型方差分析，7個(gè)因素中有pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、孢子懸液接種量、發(fā)酵時(shí)間、葡萄糖6個(gè)因素顯著(P<0.05)(表3)，說明該6個(gè)因素對焦曲霉生產(chǎn)色素具有較大影響，而蛋白胨的量對色素的產(chǎn)生影響不顯著。R2為99.2%，說明99.2%試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以以此模型解釋，達(dá)到試驗(yàn)要求，P值為0，該模型具有顯著意義(表4)。應(yīng)用MatlabR2012b軟件解方程1獲得焦曲霉產(chǎn)色素最優(yōu)條件為：pH 7.1、溫度 25.8 ℃、轉(zhuǎn)速221.8 r/min、脫色時(shí)間128.7 h、接種量2.8 mL/150mL、葡萄糖16 g/L、蛋白胨12 g/L，色素理論產(chǎn)量OD值2.62，在最優(yōu)脫色條件下作驗(yàn)證試驗(yàn)，色素OD值達(dá)到2.48，與預(yù)測值相仿。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

表4 回歸模型方差分析

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)微生物均能產(chǎn)生色素，且很多色素具有生物學(xué)活性，如抗菌、抗癌、抗輻射和抗氧化等，但實(shí)際應(yīng)用較少，目前唯一能夠大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用的只有紅曲色素，主要是由于微生物色素的穩(wěn)定性易受到外界物化因素的影響，優(yōu)良產(chǎn)色素菌株的缺乏、色素往往伴隨著毒素的產(chǎn)生以及色素提純較難等，限制了微生物色素的實(shí)際應(yīng)用[10]。本研究分離的1株焦曲霉，產(chǎn)生的色素豐富，色澤鮮艷，且是胞外水溶性的色素，易于提取，為實(shí)際應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。

色素的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，有利于研究紅色素的功能性及其穩(wěn)定性，薄層層析法、柱層析法、HPLC、GC-MS等都是色素分離純化的主要方法[11-12]。硅膠薄層層析以及柱層析分離純化色素操作方便，分析速度快，分離效果好，不需要昂貴的儀器設(shè)備，只要通過使用不同的展開劑，就能夠得到所需要的色素條帶，并且結(jié)果直觀、分離能力較好[13]。本研究得到的焦曲霉色素，利用不同的展開劑在硅膠板上進(jìn)行薄層層析，能得到單一斑點(diǎn)的色素，分離效果較好，并通過柱層析得到色素精提物濾液，以便進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定。GC-MS色譜圖顯示，檢測出色素主要有2種物質(zhì)，氣化溫度分別在235 ℃與265 ℃左右，質(zhì)譜檢測并與NIST圖庫比對，得到了2種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，分別為吡咯吡嗪二酮與二蒽酮類，顯示的結(jié)構(gòu)與紅外檢測的基團(tuán)吸收峰基本一致，吡咯吡嗪二酮類是一種擬肽化合物，具有保護(hù)神經(jīng)、抗菌等多種生物活性[14]，而且吡咯吡嗪二酮作為發(fā)色體應(yīng)用于染料工業(yè)中，該發(fā)色體，色澤明亮，多為橙黃色[15]；而作為母體結(jié)構(gòu)的二蒽酮類是一般呈黃色，二蒽酮類衍生物主要存在豆科灌木植物狹葉或尖葉番茄中，是一種植物性聚酮類色素，具有瀉下、止血、抗菌抗病毒的功能[16-17]；蒽醌和萘醌等聚酮類化合物是真菌常見的色素類化合物，已發(fā)現(xiàn)了大約700種蒽醌類化合物，如常見且應(yīng)用于食品工業(yè)的紅曲霉素就是由紅曲霉產(chǎn)生的聚酮類色素[18]，但具有二蒽酮結(jié)構(gòu)的聚酮類色素產(chǎn)生還未見報(bào)道，因此，焦曲霉色素可能同時(shí)含有吡咯吡嗪二酮與二蒽酮類化學(xué)結(jié)構(gòu)的一種復(fù)合色素，是一種全新的微生物源類色素，且該兩種物質(zhì)結(jié)構(gòu)具有較多的生物活性，后續(xù)需進(jìn)一步對該色素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，包括高溫、光照、重金屬以及還原與氧化劑對色素穩(wěn)定性的影響，為實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。均勻設(shè)計(jì)法常應(yīng)用于因素水平較多的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，相比于正交設(shè)計(jì)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)，具有試驗(yàn)次數(shù)少、布點(diǎn)更均勻、更高效等特點(diǎn)，能夠快速有效地實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化[19-20]。