李俊國，胡美姣，弓德強(qiáng)，母軍霞，王偉博，高兆銀，李敏，谷會(huì)，陳千付，雷新濤*

1(海南大學(xué) 園藝學(xué)院，海南 ?？冢?70228)2(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?，571101)3(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口，571101)4(海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?，571101)

炭疽菌是一類重要的致病真菌，主要包括膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)、博寧炭疽菌(Colletotrichumboninense)[1-3]等，分布范圍極廣，熱帶、亞熱帶甚至溫帶的植物都可能成為其寄主。多種炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)的真菌可誘發(fā)炭疽病[4]，危害杧果、茶樹、百香果、番木瓜等[5-8]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。杧果是著名的熱帶水果之一，作為我國重要的熱帶、亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物，其主要的采后病害包括炭疽病、蒂腐病和果腐病等[9]。近年來，炭疽病成為危害杧果的采前生長期和采后貯藏階段最嚴(yán)重的病害之一[10]，嚴(yán)重時(shí)甚至造成絕產(chǎn)[11]。該病最初在杧果皮上潛伏，直到果實(shí)發(fā)育的最后階段發(fā)病導(dǎo)致果實(shí)腐爛[12]。生產(chǎn)上對(duì)杧果果實(shí)采后炭疽病的防治多是使用化學(xué)殺菌劑，高效但極易出現(xiàn)殘留，會(huì)損傷果實(shí)質(zhì)量和危害人體健康，因此，開發(fā)高效和無殘留、無毒害的抑制劑尤為重要。

植物精油是芳香植物的高度濃縮提取物，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，具有揮發(fā)性，油狀液體物質(zhì)[13]，大多具有還原性、抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑，同時(shí)具有安全環(huán)保、低毒低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，常用于鮮切水果、果蔬保鮮以及作物腐敗菌和致病菌的控制[14]。植物精油在果蔬保鮮抗病等方面取得顯著的效果，可有效抑制荔枝的褐變、腐敗[15]，多種精油對(duì)鏈格孢霉(Alternariaalternata)、指狀青霉(Penicilliumdigitatum)、灰霉(Botrytiscinerea)有較強(qiáng)的抑制作用[16]，芥末精油能抑制杧果炭疽菌和蒂腐病菌在杧果果實(shí)上的生長[17]。丁香精油對(duì)番茄灰霉病有較好的抑制效果，能有效抑制櫻桃番茄的自然腐爛[18]。

本試驗(yàn)通過10種植物精油對(duì)杧果炭疽菌的離體抑菌效果，篩選出對(duì)杧果炭疽菌的最佳抑制精油及其濃度，探討丁香精油對(duì)杧果炭疽菌的防治和品質(zhì)的影響，以期為丁香精油對(duì)杧果炭疽菌抑制機(jī)理的深入研究及杧果炭疽病防治機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試杧果炭疽病菌(C.gloeosporioides)為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所采后病害與保鮮課題組提供。

丁香精油、肉桂精油、茶樹精油、香茅精油、樟腦精油、玫瑰草精油、草果精油、山茶花精油、橄欖精油和檸檬精油，上海源葉生物科技有限公司。

供試品種為杧果品種“貴妃杧”，購于廣西百色國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)杧果園。

1.2 儀器與設(shè)備

電子計(jì)重稱，上海英展機(jī)電企業(yè)有限公司；GY-4型果實(shí)硬度計(jì)，浙江托普儀器有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PAL-1型手持糖度計(jì)，日本Atago株式會(huì)社；恒溫培養(yǎng)箱，艾力特國際貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 10種植物精油對(duì)杧果炭疽菌離體抑制效果測(cè)定

采用生長速率法測(cè)定。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用含藥平板法進(jìn)行植物精油對(duì)杧果炭疽菌的抑菌試驗(yàn)，配制如表1中設(shè)定好的系列精油濃度的PDA培養(yǎng)基(45 mL)，倒入3個(gè)培養(yǎng)皿中，取PDA培養(yǎng)基上生長7 d的供試菌株，用直徑5 mm的無菌打孔器在其菌落邊緣均勻打孔，并將菌餅每皿1塊接入上述設(shè)定好濃度的帶藥培養(yǎng)基和不含精油對(duì)照培養(yǎng)基中心，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照組病原菌生長至第7天，采用十字交叉法，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，并查出對(duì)應(yīng)的抑菌幾率值。以濃度對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，抑制幾率值(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程Y=a+bX和相關(guān)系數(shù)(r)，并由回歸方程計(jì)算抑制菌落擴(kuò)展的有效濃度EC50值和EC90。菌落生長抑制率按公式(1)計(jì)算：

表1 植物精油設(shè)定濃度

抑菌率/%

(1)

1.3.2 丁香精油對(duì)貴妃杧刺傷接種后發(fā)病的影響

選取大小基本一致，無機(jī)械損傷，果皮表面光滑的貴妃杧，結(jié)合體外抑制結(jié)果，配制0.2、0.5、1.0、2.0 和4.0 μL/mL的丁香精油溶液，每個(gè)濃度9個(gè)果實(shí)，用5 mm打孔器在果面上均勻打6個(gè)孔，然后放入配制好的精油溶液中浸泡5 min，取出晾干，然后分別接入5 mm杧果炭疽菌菌餅，置于保鮮盒中，室溫貯藏，每3 d統(tǒng)計(jì)1次病斑直徑和發(fā)病指數(shù)，病斑直徑用直尺十字交叉法測(cè)定2次，取平均值。

參照覃麗萍等[19]的病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無病癥；1級(jí)，d(病斑直徑)<5 mm；2級(jí)，5 mm40 mm。病情指數(shù)計(jì)算如公式(2)所示:

病情指數(shù)

(2)

1.3.3 丁香精油對(duì)貴妃杧自然發(fā)病的影響

每個(gè)處理20個(gè)果，3次重復(fù)，然后放入配制好的2.0 μL/mL丁香精油溶液中浸泡5 min，以清水浸泡為對(duì)照，取出自然晾干，每3 d觀察1次，統(tǒng)計(jì)自然發(fā)病個(gè)數(shù)及發(fā)病等級(jí)，計(jì)算發(fā)病指數(shù)和防效，如公式(3)和公式(4)所示。參照弓德強(qiáng)等[20]的方法，將病情按輕重分為5級(jí)：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，出現(xiàn)零星腐爛斑點(diǎn)；2級(jí)，病斑面積占果實(shí)總面積的 25%以下；3級(jí)，病斑面積占果實(shí)總面積的25%～50%；4級(jí)，病斑面積占果實(shí)總面積的50%以上。

(3)

(4)

1.3.4 丁香精油對(duì)貴妃杧采后品質(zhì)的影響

選取大小基本一致，無機(jī)械損傷，果皮表面光滑的貴妃杧，然后放入2.0 μL/mL丁香精油溶液中浸泡5 min，以清水浸泡為對(duì)照，取出自然晾干，然后放入保鮮盒內(nèi)，每個(gè)處理10個(gè)果，3次重復(fù)，每隔3 d取樣。

質(zhì)量損失率直接采用稱量法；硬度采用硬度計(jì)進(jìn)行測(cè)定；可溶性固形物采用手持糖度計(jì)測(cè)定；可滴定酸用糖酸測(cè)定器測(cè)定；維生素C含量采用液相色譜測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香精油對(duì)杧果炭疽病原菌生長的影響

10種植物精油對(duì)杧果炭疽菌均具有抑制效果，如表2 所示。從EC50值來看，丁香精油、肉桂精油、茶樹精油、香茅精油和樟腦精油可歸為一類，EC50值均小于1.0 μL/mL 抑菌效果較強(qiáng)；其次為玫瑰草油和橄欖精油，草果精油、山茶花精油和檸檬精油EC50值大于1.0 μL/mL，其中抑菌效果最弱為草果精油、山茶花精油和檸檬精油，EC50值均大于2.0 μL/mL；從EC90值來看，丁香精油歸為一類，EC90值為0.565 μL/mL，肉桂精油、茶樹精油和樟腦精油歸為一類，EC90值均小于10.0 μL/mL，最后是香茅精油、玫瑰草油、橄欖精油、草果精油、山茶花精油和檸檬精油，EC90值均大于10.0 μL/mL?？傮w來看，丁香精油的抑菌效果最強(qiáng)，EC50值和EC90值分別為0.194 μL/mL和0.565 μL/mL。

表2 植物精油對(duì)杧果炭疽菌菌落生長抑制效果

2.2 丁香精油對(duì)貴妃杧刺傷接種后發(fā)病的影響

丁香精油在杧果進(jìn)行刺傷接種試驗(yàn)結(jié)果表明，在貯藏期間，接種了杧果炭疽菌的貴妃果實(shí)，病斑直徑不斷擴(kuò)大，不同濃度的丁香精油對(duì)杧果炭疽菌均有不同程度的抑制作用(表3、表4)。3 d時(shí)，1.0、2.0、4.0 μL/mL處理病斑直徑和病情指數(shù)與對(duì)照有顯著性差異(P<0.05)；6 d和9 d時(shí)，各處理均能顯著抑制病斑直徑擴(kuò)展(P<0.05)；但9 d時(shí)，僅有1.0 μL/mL和2.0 μL/mL處理病情指數(shù)與對(duì)照有顯著性差異(P<0.05)；12 d時(shí)，各處理均能顯著性抑制杧果炭疽菌病斑擴(kuò)展(P<0.05)，0.5、1.0、2.0 μL/mL處理組病情指數(shù)與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。總體來看，2.0 μL/mL丁香精油處理效果最好，病斑直徑僅為10.45 cm，病情指數(shù)為46.25，與其他處理有顯著性差異(P<0.05)。由此可知，2.0 μL/mL丁香精油的處理效果最好，可有效抑制炭疽病害直徑擴(kuò)展。

表3 丁香精油對(duì)貴妃杧炭疽病病斑直徑的影響

表4 丁香精油對(duì)貴妃杧炭疽病病情指數(shù)的影響

綜合丁香精油對(duì)杧果炭疽病病斑直徑和病情指數(shù)的影響，篩選出2.0 μL/mL為丁香精油最適處理濃度，并將其應(yīng)用于貴妃杧采后品質(zhì)試驗(yàn)。

2.3 丁香精油對(duì)貴妃杧自然發(fā)病的影響

貴妃杧在常溫下貯藏，清水浸泡對(duì)照發(fā)病情況最嚴(yán)重，丁香精油處理和清水處理在病情指數(shù)上出現(xiàn)差異顯著(表5)，在防效上，2.0 μL/mL丁香精油處理能夠有效地防止貴妃杧采后自然病害的發(fā)生，能延長果實(shí)貨架期。貯藏第9天時(shí)，貴妃杧開始自然發(fā)病，2.0 μL/mL 處理和對(duì)照病情指數(shù)達(dá)到顯著差異水平，防效為54.59%；12 d時(shí)，2.0 μL/mL的防效下降至52.63%，下降幅度較緩，且病情指數(shù)差異顯著；說明2.0 μL/mL處理對(duì)貴妃杧采后貯藏前期預(yù)防自然發(fā)病防治效果較好，貯藏后期出現(xiàn)自然發(fā)病現(xiàn)象后，防治效果減弱。

表5 丁香精油對(duì)貴妃杧采后炭疽病的影響

2.4 丁香精油對(duì)貴妃杧采后品質(zhì)的影響

2.4.1 丁香精油對(duì)貴妃杧失重率的影響

隨著貯藏時(shí)間的延長，處理和對(duì)照的失重率均逐漸變大，具體如圖1所示。貴妃杧在整個(gè)貯藏期間，失重率逐漸增大，其中對(duì)照貴妃杧失重率最高，貯藏12 d 時(shí)貴妃杧的失重率為3.38%，而2.0 μL/mL處理的失重率僅為0.68%。從貯藏第6天開始，對(duì)照出現(xiàn)質(zhì)量損失，而丁香精油2.0 μL/mL處理還未出現(xiàn)，且后面的貯藏期間失重率都顯著低于對(duì)照(P<0.05)，說明丁香精油2.0 μL/mL處理可明顯降低貴妃果實(shí)貯藏后期果實(shí)失重率的上升速度，從而達(dá)到抑制失重的效果。

圖1 貴妃杧失重率的變化

2.4.2 丁香精油對(duì)貴妃杧果實(shí)硬度的影響

丁香精油處理貴妃果實(shí)的硬度隨貯藏時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照呈下降趨勢(shì)，如圖2所示。2.0 μL/mL處理貯藏第3天時(shí)，其硬度出現(xiàn)上升，其硬度為21.35 kg/cm2，與對(duì)照出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)；在貯藏第6天時(shí)，2.0 μL/mL處理與對(duì)照達(dá)到差異顯著水平(P<0.05)；在貯藏第9天時(shí)，對(duì)照與2.0 μL/mL處理硬度下降幅度變大，硬度分別為8.93 kg/cm2和，差異不顯著(P>0.05)；貯藏12 d時(shí)，2.0 μL/mL處理出現(xiàn)硬度大幅度下降，其硬度為1.76 kg/cm2，與對(duì)照沒有出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)；從整個(gè)貯藏階段來看，2.0 μL/mL處理的硬度變化比對(duì)照的小，在貯藏過程中與對(duì)照保持有較大的硬度差異。

圖2 貴妃杧果實(shí)硬度的變化

2.4.3 丁香精油對(duì)貴妃杧TSS含量的影響

丁香精油處理對(duì)貴妃杧果實(shí)的可溶性固形物的影響如圖3所示，2.0 μL/mL處理和對(duì)照的可溶性固形物含量在貯藏期間總體呈上升趨勢(shì)。在貯藏第3天前，處理和對(duì)照可溶性固形物含量輕微下降，在貯藏時(shí)間為3～6 d時(shí)，處理和對(duì)照可溶性固形物含量呈上升趨勢(shì)，且差異不顯著(P>0.05),在第12天時(shí)，處理和對(duì)照可溶性固形物含量持續(xù)上升，且2.0 μL/mL 處理與對(duì)照出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，可溶性固形物含量分別為13.52%、12.46%，結(jié)果表明貴妃杧貯藏過程中丁香精油處理的濃度對(duì)可溶性固形物含量的影響并不大，保持了貴妃杧正常的甜度變化。

圖3 貴妃杧可溶性固形物含量的變化

2.4.4 丁香精油對(duì)貴妃杧可滴定酸含量的影響

貴妃杧采后貯藏期間，丁香精油處理和對(duì)照的可滴定酸含量呈下降趨勢(shì)如圖4所示。在貯藏前6 d，對(duì)照的可滴定酸含量高于2.0 μL/mL處理，含量分別為2.28%和2.20%，含量間無顯著差異(P>0.05)；貯藏6～12 d，2.0 μL/mL處理的可滴定酸含量高于對(duì)照，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 貴妃杧可滴定酸含量的變化

2.4.5 丁香精油對(duì)貴妃杧維生素C含量的影響

如圖5所示，丁香精油處理和對(duì)照貴妃杧果實(shí)的維生素C含量均隨著貯藏時(shí)間的延長而降低，貯藏3 d時(shí)，2.0 μL/mL處理和對(duì)照維生素C含量下降最快，2.0 μL/mL處理維生素C含量為6.82 mg/100g，對(duì)照含量為4.80 mg/100g，差異顯著(P<0.05)。貯藏6 d時(shí)，對(duì)照維生素C含量下降幅度較緩，為4.68 mg/100g，而2.0 μL/mL處理持續(xù)下降，維生素C含量為5.23 mg/100g，差異不顯著(P>0.05)。貯藏9 d時(shí)，2.0 μL/mL處理和對(duì)照差異顯著(P<0.05)。貯藏12 d時(shí)，2.0 μL/mL處理和對(duì)照維生素C含量分別為3.52和3.56 mg/100g，差異不顯著(P>0.05)?？傮w來看，2.0 μL/mL處理的維生素C含量高于對(duì)照，說明濃度為2.0 μL/mL的丁香精油處理后，有效延緩了貴妃杧果實(shí)維生素C含量的下降，有效維持了貴妃杧果實(shí)的新鮮度。

圖5 貴妃杧維生素C含量的變化

3 討論與結(jié)論

丁香精油對(duì)很多果蔬致病菌具有廣譜抑制作用。王丹等[21]發(fā)現(xiàn)丁香精油在0.40～0.80 μL/mL可有效抑制灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、鏈格孢菌(A.alternata)和膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的菌絲體生長。本試驗(yàn)測(cè)定10種植物精油對(duì)杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)的菌絲體生長抑制作用，篩選出丁香精油抑制效果最好，與王丹等[21]結(jié)果一致，說明丁香精油具有抑制貴妃杧采后炭疽病的潛力。

丁香精油作為一種天然保鮮劑，對(duì)果蔬采后保鮮具有一定的增效作用。李寧等[22]研究發(fā)現(xiàn)丁香精油對(duì)圣女果具有較強(qiáng)的防腐效果，5.0 μL/mL丁香精油能顯著抑制圣女果軟腐病，提高好果率。李鵬霞等[23]發(fā)現(xiàn)丁香精油能夠抑制蘋果采后病害發(fā)生，減緩硬度下降的速度，并且能有效保持蘋果的可滴定酸含量，有利于保持蘋果的品質(zhì)和風(fēng)味；李寧等[24]發(fā)現(xiàn)0.50%丁香精油處理有助于抑制冬棗采后腐爛，提高抗病性，還具有較好的保鮮效果，保持冬棗品質(zhì)；黃巍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，貯藏期間0.60%丁香精油可有效抑制水蜜桃失重，并且有利于維持水蜜桃的可溶性固形物和維生素C含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明2.0 μL/mL丁香精油處理能有效抑制貴妃杧刺傷接種后病情指數(shù)和自然發(fā)病病情指數(shù)；說明2.0 μL/mL丁香精油對(duì)杧果采后炭疽病具有良好的抑制效果；同時(shí)可明顯抑制貴妃杧果實(shí)失重，減緩果實(shí)硬度下降，并且有效維持果實(shí)可滴定酸和維生素C含量，貯藏后期有較高的可溶性固形物含量。

綜上所述，丁香精油對(duì)杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)具有良好的抑制效果，能夠作為殺菌劑應(yīng)用于杧果采后病害防控，并且在一定濃度處理下，能有效維持杧果采后品質(zhì)和風(fēng)味。

植物精油對(duì)果蔬采后保鮮的研究報(bào)道越來越多，傳統(tǒng)精油處理技術(shù)主要為精油浸泡法、噴灑法和熏蒸法，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中的應(yīng)用存在一些問題：(1)精油處理果實(shí)后，揮發(fā)性物質(zhì)在果實(shí)表面殘留，影響果實(shí)本身的風(fēng)味；(2)在精油處理過程中，精油濃度過高或處理不當(dāng)，會(huì)對(duì)果實(shí)造成藥害。因此更高效的精油處理技術(shù)有待深入研究，如丁香油-殼聚糖復(fù)合抑菌劑、精油微膠囊化和抑菌紙法等，從而有利于在果蔬貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中控制質(zhì)量安全，防止品質(zhì)劣變。隨著精油處理技術(shù)不斷發(fā)展，植物精油開發(fā)利用的前景會(huì)越來越廣闊。