黃芷珊，任紅,2,3,4,5，黃煒健，劉少韻，謝卓珊，鐘先鋒,2,3,4,5，黃桂東,2,3,4,5*

1(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山，528231)2(廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山，528231)3(廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山，528231)4(佛山市釀造工程技術(shù)研究中心，廣東 佛山，528231)5(佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心, 廣東 佛山，528231)

糯米酒是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵酒之一，其釀造過(guò)程多采用開(kāi)放式發(fā)酵，故釀造過(guò)程形成了復(fù)雜的微生物環(huán)境，擁有豐富的微生物資源[1]，從中篩選出對(duì)酒風(fēng)味物質(zhì)形成和成品酒品質(zhì)起作用的性能良好菌株已成為釀酒行業(yè)重要研究方向之一。

貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌屬中的新種，廣泛存在于土壤、水體、空氣等自然環(huán)境中[2]。國(guó)內(nèi)外科學(xué)家也相繼從白酒[3]、豆豉[4]等發(fā)酵食品中分離篩選出貝萊斯芽孢桿菌。研究表明：貝萊斯芽孢桿菌具有生長(zhǎng)繁殖速率快、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)酶能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可作為發(fā)酵劑等應(yīng)用于食品生產(chǎn)中[5]，具有廣闊應(yīng)用前景。但是芽孢桿菌在其應(yīng)用過(guò)程中的安全風(fēng)險(xiǎn)仍未明確。劉純等[6]以商用益生芽孢桿菌為基礎(chǔ)，對(duì)其安全性展開(kāi)研究，結(jié)果顯示被檢測(cè)菌株都攜帶有一種或多種腸毒素基因。歐洲某飼料添加劑中的蠟狀芽孢桿菌因攜帶含tetB基因的質(zhì)粒，存在潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)而被停止使用[7]。由此可見(jiàn)，貝萊斯芽孢桿菌生物安全性評(píng)價(jià)仍是值得深入探討的科學(xué)問(wèn)題，對(duì)其后續(xù)進(jìn)一步深入研究與資源開(kāi)發(fā)尤為必要。

本實(shí)驗(yàn)室前期從糯米酒中分離得到抗逆性強(qiáng)且產(chǎn)蛋白酶特性優(yōu)良的貝萊斯芽孢桿菌共4株，但尚不了解其生物安全性，為充分開(kāi)發(fā)其使用價(jià)值，本文從耐藥性檢測(cè)、耐藥質(zhì)粒檢測(cè)、溶血實(shí)驗(yàn)、毒力基因PCR檢測(cè)4個(gè)方面開(kāi)展體外安全性評(píng)價(jià)，以期為糯米酒中貝萊斯芽孢桿菌菌株資源的挖掘與利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株：貝萊斯芽孢桿菌B1、B2、B7、B8，均為本實(shí)驗(yàn)室前期從糯米酒中分離得到。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)，南京茂捷微生物科技有限公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Plasmid Minikit試劑盒，美國(guó)OMEGA Bio-tek公司；哥倫比亞血平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片(四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、萬(wàn)古霉素、紅霉素、氯霉素、鏈霉素)，杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ALLEGRA-64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；SY-1220恒溫水浴鍋，美國(guó)精騏有限公司；EPOCH-2 721BR超微量酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；FlexCycler2 PCR儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；DYY-7C凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司；721BR 16103凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó) Bio-Rad 公司；GR60DA全自動(dòng)滅菌鍋，致微(廈門(mén))儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ME104電子分析天平，梅特勒—托利多精密儀器公司；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；428830數(shù)顯式游標(biāo)卡尺，寧波長(zhǎng)城精工實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 材料與試劑

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌菌液的制備

將4株貝萊斯芽孢桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min下活化2代后待用。

1.3.2 耐藥性檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)方法[8]，適當(dāng)修改如下：采用藥敏紙片擴(kuò)散法對(duì)本研究實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行藥敏分析。實(shí)驗(yàn)使用的藥敏紙片種類為慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素共7種。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[9]，通過(guò)測(cè)量各藥敏試紙產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小判斷菌株對(duì)不同抗生素的敏感性，如表1所示。

表1 耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 耐藥質(zhì)粒檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)方法[6]，適當(dāng)修改如下：使用Plasmid Minikit試劑盒對(duì)上述藥敏實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果中呈耐藥結(jié)果的菌株進(jìn)行質(zhì)粒提取。以不含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α為陰性對(duì)照，以含質(zhì)粒的大腸桿菌PET-28a為陽(yáng)性對(duì)照，使用0.8%(質(zhì)量濃度)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒存在情況。

1.3.4 溶血實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)方法[10]，取本研究實(shí)驗(yàn)菌株于血瓊脂培養(yǎng)基上接種，37 ℃培養(yǎng)14～18 h，觀察是否產(chǎn)生溶血環(huán)。若菌落四周出現(xiàn)草綠色環(huán)，則為α-溶血；若菌落四周出現(xiàn)透明溶血環(huán)，則為β-溶血；若菌落四周無(wú)任何變化，則為γ-溶血，即不溶血。

1.3.5 毒力基因PCR檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)方法[6]，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)本研究實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行芽孢桿菌常見(jiàn)毒力基因檢測(cè)，檢測(cè)的毒力基因包括與腸毒素相關(guān)的溶血性腸毒素Hbl(hblA、hblC、hblD)、非溶血性腸毒素Nhe(nheA、nheB、nheC)、腸毒素T(bceT)、細(xì)胞毒素K(cytK)基因以及與嘔吐毒素相關(guān)的ces和cer基因。通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株中所含毒力基因的情況，對(duì)菌株的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥性檢測(cè)結(jié)果與分析

為評(píng)估實(shí)驗(yàn)室篩選所得的貝萊斯芽孢桿菌的安全性，本文使用了慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素以及萬(wàn)古霉素等7種抗生素進(jìn)行測(cè)定。由表2可知,對(duì)照菌株金黃色葡萄球菌對(duì)7種抗生素均敏感；4株貝萊斯芽孢桿菌對(duì)慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素敏感；菌株B1、B7、B8對(duì)四環(huán)素中度敏感，菌株B2對(duì)四環(huán)素耐藥。這與高艷俠[11]和AMOAH等[12]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，前者研究表明貝萊斯芽孢桿菌LF01對(duì)慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素和四環(huán)素皆敏感；后者對(duì)貝萊斯芽孢桿菌GPSAK4進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，表明GPSAK4對(duì)慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素敏感。這可能是由于氨基糖苷類抗生素慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素可與細(xì)菌核糖體的30S亞基形成不可逆結(jié)合[13]，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素和氯霉素類氯霉素可透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)菌核糖體的50S亞基形成可逆結(jié)合[14]，來(lái)抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成；糖肽類抗生素萬(wàn)古霉素可通過(guò)作用于細(xì)胞壁上的D-丙氨酰-D-丙氨酸、阻礙多肽的形成，來(lái)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成[15]，從而對(duì)細(xì)菌起到抑制作用。

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)判斷結(jié)果 單位：mm

4株貝萊斯芽孢桿菌對(duì)同一種抗生素敏感程度有所差異。如圖1-a所示，4株貝萊斯芽孢桿菌對(duì)慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素的耐藥性均呈顯著差異(P<0.05)，對(duì)鏈霉素、萬(wàn)古霉素的耐藥性則無(wú)顯著差異(P>0.05)。慶大霉素對(duì)B8的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)B7的抑制效果次之，對(duì)B1、B2的抑制效果最弱，且慶大霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與B1、B2、B7、B8呈顯著性差異(P<0.05)；卡那霉素對(duì)B7、B8的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)B1、B2的抑制效果最弱，且卡那霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌皆呈顯著性差異(P<0.05)；四環(huán)素對(duì)B1的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)B2的抑制效果最弱；四環(huán)素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌株皆呈顯著性差異(P<0.05)；紅霉素對(duì)B2的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)B7的抑制效果次之，對(duì)B8、B1的抑制效果最弱，紅霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌株皆呈顯著性差異(P<0.05)；氯霉素對(duì)B8的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)B7、B1的抑制效果次之，對(duì)B2的抑制效果最弱，且氯霉素對(duì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果與4株菌株皆呈顯著性差異(P<0.05)。

7種抗生素對(duì)同一菌株的抑制效果亦有所不同。如圖1-b所示，氯霉素對(duì)4株菌的抑制效果最強(qiáng)，四環(huán)素對(duì)4株菌的抑制效果最弱。此外，紅霉素與氯霉素對(duì)B2、慶大霉素與氯霉素對(duì)B8的抑制效果無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明紅霉素對(duì)B2、慶大霉素對(duì)B8的抑制效果也是最強(qiáng)的。

a-不同菌株同一抗生素的耐藥性分析；b-不同抗生素同一菌株的耐藥性分析

隨著抗生素的廣泛使用，細(xì)菌抗生素耐藥性問(wèn)題逐漸成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)，減少耐藥菌株的傳播成為維護(hù)公共衛(wèi)生安全的關(guān)鍵之一。2013年，歐洲食品安全局安全資格認(rèn)證列表中提出，將抗生素耐藥性測(cè)定列為微生物菌種通用安全評(píng)估項(xiàng)目[16]，因此對(duì)菌株進(jìn)行耐藥性測(cè)定尤為重要。

2.2 耐藥質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果與分析

圖2為對(duì)上述存在耐藥性的菌株的質(zhì)粒提取電泳圖，B2所在的泳道(泳道1)和陰性對(duì)照泳道(泳道2)上并未出現(xiàn)條帶，而陽(yáng)性對(duì)照所在的泳道上(泳道3)上出現(xiàn)了熒光條帶，表明B2中無(wú)攜帶耐藥基因的質(zhì)粒存在，不具備通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移耐藥性的可能性，故可初步判斷B2在耐藥性轉(zhuǎn)移方面為安全菌株。

1-B2；2-陰性對(duì)照；3-陽(yáng)性對(duì)照；M-15 000 DNA marker

細(xì)菌耐藥性存在轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，在自然條件下，耐藥基因可通過(guò)質(zhì)粒在不同種屬間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[17]。已有研究表明，當(dāng)含有耐藥基因菌株作用于腸道時(shí)，耐藥基因不僅可以在腸道菌群間進(jìn)行交換，還可以轉(zhuǎn)移到短暫通過(guò)腸道的細(xì)菌中，當(dāng)腸道中的條件致病菌獲得耐藥性時(shí)，將會(huì)對(duì)宿主健康造成一定危害[18]。

目前關(guān)于芽孢桿菌通過(guò)質(zhì)粒等移動(dòng)元件將耐藥基因傳遞至其他菌株的現(xiàn)象已有報(bào)道。AGERS?等[19]發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌中的四環(huán)素耐藥基因可通過(guò)移動(dòng)元件轉(zhuǎn)移至枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和腸球菌中。盧俊杰[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明耐藥枯草芽孢桿菌質(zhì)粒中的四環(huán)素類耐藥基因tet(K)可通過(guò)接合的方式轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中。因此，為避免篩選所得的貝萊斯芽孢桿菌抗生素耐藥性向其他菌株、動(dòng)物甚至人類轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)具有耐藥性的菌株進(jìn)行耐藥質(zhì)粒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)尤為重要。

2.3 溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

溶血素是一類作用于細(xì)胞膜，能使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生紊亂、細(xì)胞內(nèi)容物外泄、細(xì)胞死亡的蛋白毒素[21]。研究表明，溶血素除了對(duì)血細(xì)胞有溶解作用外，還能對(duì)有核細(xì)胞和血小板造成損傷和致死[22]，因此，菌株是否產(chǎn)生溶血素是檢驗(yàn)菌株安全性的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，對(duì)菌株的開(kāi)發(fā)與利用至關(guān)重要。圖3為實(shí)驗(yàn)室篩選所得的4株貝萊斯芽孢桿菌溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖可知，4株菌株菌落周圍無(wú)產(chǎn)生透明溶血環(huán)及草綠色環(huán)情況，這與BORAH等[23]的結(jié)果一致，因此可判斷菌株為γ-溶血，菌株B1、B2、B7、B8為安全菌株。

a-貝萊斯芽孢桿菌B1；b-貝萊斯芽孢桿菌B2；c-貝萊斯芽孢桿菌B7；d-貝萊斯芽孢桿菌B8

2.4 毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果

芽孢桿菌中是否攜帶毒力基因是判斷菌株是否安全的一個(gè)重要方面。圖4與表3為4株芽孢桿菌進(jìn)行毒力基因PCR的檢測(cè)結(jié)果。

1～10-毒力基因hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、bceT、cytK、ces、cer；M-2 000 DNA marker

表3 貝萊斯芽孢桿菌B1、B2、B7、B8毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，除菌株B2外，B1、B7、B8均檢測(cè)出一種或兩種毒力基因。在產(chǎn)溶血性腸毒素基因檢測(cè)方面，除菌株B2、B7外，菌株B1、B8皆檢測(cè)出攜帶有溶血性腸毒素hblA(1 154 bp)基因，4株菌株皆不攜帶溶血性腸毒素hblC(740 bp)和hblD(829 bp)基因；在非溶血性腸毒素基因檢測(cè)方面，除菌株B2外，菌株B1、B7、B8皆攜帶有非溶血性腸毒素nheC(683 bp)基因，4株菌株皆不攜帶非溶血性腸毒素nheA(755 bp)、nheB(743 bp)基因。在其他產(chǎn)腸毒素基因檢測(cè)方面，4株菌株皆不攜帶有腸毒素TbceT(924 bp)基因，不攜帶有產(chǎn)細(xì)胞毒素KcytK(809 bp)基因；在產(chǎn)嘔吐毒素基因檢測(cè)方面，4株菌株皆不攜帶有產(chǎn)嘔吐毒素ces(699 bp)以及cer(370 bp)基因。貝萊斯芽孢桿菌的安全性與其攜帶的毒力基因直接相關(guān)，溶血性腸毒素和非溶血性腸毒素均為復(fù)合型毒素，溶血性腸毒素分別由hblA、hblB、hblC、hblD4個(gè)毒力基因編碼，非溶血性腸毒素由nheA、nheB、nheC3個(gè)毒力基因編碼，當(dāng)所有組分共同參與時(shí)，毒性達(dá)到最大[24]。研究表明，溶血性腸毒素需要hblA、hblC、hblD共同表達(dá)時(shí)才能產(chǎn)生溶血素[6]，單獨(dú)或成對(duì)的非溶血性腸毒素Nhe成分無(wú)法對(duì)蛋白起到抑制作用[25]，故可判斷本實(shí)驗(yàn)中4株菌株為安全菌株。

3 結(jié)論

本研究對(duì)分離自糯米酒中的4株抗逆性強(qiáng)且產(chǎn)蛋白酶特性優(yōu)良的貝萊斯芽孢桿菌進(jìn)行了體外安全性研究。在耐藥性檢測(cè)中，抗生素慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、萬(wàn)古霉素對(duì)菌株有較強(qiáng)的抑制作用，4株菌均對(duì)上述抗生素敏感；四環(huán)素對(duì)菌株的抑制效果較弱，菌株B1、B7、B8對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)為中度敏感，菌株B2對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)為耐藥。對(duì)耐藥性檢測(cè)中具有四環(huán)素耐藥性的菌株B2進(jìn)行耐藥質(zhì)粒檢測(cè)，結(jié)果顯示，菌株B2中不存在耐藥基因的質(zhì)粒，不具備耐藥性通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的可能。在溶血實(shí)驗(yàn)中，4株菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且菌落四周不產(chǎn)生透明溶血環(huán)及草綠色環(huán)，可判斷菌株不是溶血性菌株。在毒力基因PCR檢測(cè)中，部分菌株攜帶一種或兩種復(fù)合型毒素毒力基因，但由于復(fù)合型毒素需所有組分共同參與才能產(chǎn)生毒性作用，可判斷菌株不具備產(chǎn)生相關(guān)毒素的可能，故4株菌株不具備產(chǎn)生腸毒素和嘔吐毒素的可能性，表現(xiàn)出了良好的安全性，可用于后續(xù)進(jìn)一步的深入研究，為后續(xù)貝萊斯芽孢桿菌菌株資源的開(kāi)發(fā)與利用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為貝萊斯芽孢桿菌作為發(fā)酵劑用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中的應(yīng)用安全性提供科學(xué)理論依據(jù)。