許俊勇，畢然，夏偉*，陳晟*

1(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)3(江南大學(xué),教育部食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們的生活水平越來越高，人們?cè)桨l(fā)注重身體保健，社會(huì)上要求發(fā)展功能性食品的呼聲越來越強(qiáng)烈[1]。低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)便是功能性食品中一種具有天然屬性的功能性低聚糖[2]。GOS通常情況下是以D-葡萄糖為還原端殘基，再連接2～8個(gè)半乳糖的寡糖，某些情況下它的還原端也可為半乳糖[3]。GOS在高溫以及低pH下的高穩(wěn)定性讓它具有在食品工業(yè)中應(yīng)用的價(jià)值[4]，并且為了模擬母乳中的人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)的作用，GOS是目前商業(yè)嬰兒奶粉中首選的益生元添加劑[5]。

由于GOS具有優(yōu)秀的理化性質(zhì)和生理性能，國內(nèi)外有較多學(xué)者對(duì)GOS展開研究。目前制備GOS方法主要有：從自然界中提取、天然高聚糖的水解、化學(xué)合成法、酶法合成等[6-7]?，F(xiàn)有商業(yè)化GOS主要是利用β-半乳糖苷酶催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)進(jìn)行酶法制備，F(xiàn)RENZEL等[8]對(duì)幾種不同來源的商品化β-半乳糖苷酶制備GOS進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)來自環(huán)狀芽孢桿菌的商品酶轉(zhuǎn)化率最高，在40%的底物濃度下轉(zhuǎn)化率可達(dá)41%。為了提高轉(zhuǎn)化率，很多學(xué)者對(duì)現(xiàn)有的酶進(jìn)行改造，WU等[9]對(duì)Sulfolobussolfataricus來源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行改造后，轉(zhuǎn)化率可達(dá)61.7%。但是目前β-半乳糖苷酶多在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)，同時(shí)商品化酶轉(zhuǎn)化率低等原因限制了該酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

由于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)與其他的微生物相比具有優(yōu)秀的蛋白質(zhì)分泌能力[10]，可以在十分廉價(jià)的培養(yǎng)基上生長，并且在工業(yè)發(fā)酵過程中有著很好的穩(wěn)定性[11]，已被廣泛應(yīng)用于與食品加工相關(guān)蛋白的重組表達(dá)[12]。對(duì)目前常用的發(fā)酵宿主E.coli來說，B.subtilis是非致病的[12]，同時(shí)它還具有十分明確的遺傳背景，完善的基因操作工具，這些都使它作為食品代謝工程宿主具有相當(dāng)強(qiáng)的吸引力[13]。

本研究首次將來自環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的β-半乳糖苷酶基因β-Gal-Ⅱ[14]在B.subtilis中進(jìn)行了異源表達(dá)，對(duì)重組β-半乳糖苷酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)表征，同時(shí)對(duì)其制備GOS的能力進(jìn)行了研究。鑒于該酶具有優(yōu)秀的GOS制備能力，為了提高該酶的表達(dá)水平以降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本，對(duì)重組菌的搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并按照優(yōu)化后的條件成功進(jìn)行了3-L罐的放大培養(yǎng)及發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

E.coliJM109為本實(shí)驗(yàn)室保藏，B.subtilisWS9為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保藏，載體pHY300PLK為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保藏[15]。pHY300PLK是一種穿梭質(zhì)粒，其上有兩個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，可以在E.coli和B.subtilis兩種菌體內(nèi)進(jìn)行克隆，在E.coli體內(nèi)表現(xiàn)為氨芐抗性，在B.subtilis體內(nèi)表現(xiàn)為四環(huán)素抗性，同時(shí)它在B.subtilis中是一種組成型表達(dá)載體。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.1.2.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)： NaCl 10，酵母粉 5，蛋白胨 10。

LB固體培養(yǎng)基：含有20 g/L瓊脂粉的LB液體培養(yǎng)基。

TB液體培養(yǎng)基(g/L)：甘油 5，蛋白胨12 ，酵母粉24 ， KH2PO42.31 ， K2HPO412.54 。

搖瓶優(yōu)化后的培養(yǎng)基(g/L)：甘油5，玉米漿干粉7.5， 安琪酵母粉7.5， KH2PO42.31， K2HPO412.54。

3-L罐發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)： 安琪酵母粉7.5， 玉米漿干粉7.5， 葡萄糖5，MgSO4·7H2O 1， (NH4)2-H-citrate 1，(NH4)2SO42.68， Na2SO32， NaH2PO4·H2O 4， K2HPO414.6，微量元素溶液3 mL。

3-L罐發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)： 安琪酵母粉50， 玉米漿干粉50， 葡萄糖300，微量元素溶液40 mL。

微量元素溶液(g/L)： MnSO4·H2O 0.1， CoCl2·6H2O 0.18， CuSO4·5H2O 0.16， ZnSO4·7H2O 0.18,CaCl20.5， FeCl38.35， Na2-EDTA 10.05。以上培養(yǎng)基均在120 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 培養(yǎng)條件

搖瓶種子液培養(yǎng)：從保存在-80 ℃冰箱中的甘油管中，取20 μL接種到10 mL的LB中在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)8～10 h即為搖瓶種子液。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照5%的接種量轉(zhuǎn)接到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min的空氣搖床中培養(yǎng)2 h后將溫度降至 33 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

3-L罐種子液培養(yǎng)：從保存在-80 ℃的冰箱中的甘油管中，取100 μL接種到50 mL的LB中在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)8～10 h即為搖瓶種子液。

3-L罐發(fā)酵培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的3-L罐種子液100 mL轉(zhuǎn)接到含有900 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的3-L罐中，設(shè)置溫度33、37 ℃，pH 7.0，通氣量保持在1.5 L/min，維持溶氧為30%，轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián)。

1.1.3 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒(DP103)以及普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)，天根生物科技有限公司；SDS-PAGE試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、溶菌酶、氨芐青霉素，上海生工生物工程股份有限公司；DNA和蛋白Marker，東盛生物；其他試劑，上海國藥集團(tuán)有限公司，試劑級(jí)別均是分析純，安琪酵母粉、玉米漿干粉為工業(yè)級(jí)。液相檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品乳糖、異乳糖、半乳二糖，Megazyme公司；半乳糖、葡萄糖，Glycarbo公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR儀、Mini Protein 3蛋白膠電泳儀、GelDoc-it凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；3-L全自動(dòng)發(fā)酵罐、小型臺(tái)式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；恒溫培養(yǎng)箱及搖床，上海知楚儀器有限公司；722型可見光分光光度計(jì)，上海市棱光儀器廠；DYY-6C型核酸膠電泳儀，北京六一電泳儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性，對(duì)B.circulans來源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ (NCBI登錄號(hào)：QJU69416.1)的編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，由無錫天霖生物有限公司合成并連接至pET-24a(+)載體，之后通過一步克隆連接的方式進(jìn)行載體更換。以AATAAGGAGTGTCAAGAATGCGTCGTATTAACTTTAACGATAACTGG為上游引物F，以TTTTTATTACCAAGCTTTCAGTGATGGTGATGGTGGTGC為下游引物R對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(下劃線部分為載體同源臂部分)，以AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCC為上游引物F′，以TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTTTG為下游引物R′對(duì)載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收，利用一步克隆連接酶進(jìn)行連接。

將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞并涂布于帶有氨芐抗生素(100 mg/L)的LB平板，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h左右挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，酶切驗(yàn)證并送測(cè)序。

1.2.2 重組β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ的表達(dá)

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pHY300PLK-β-Gal-Ⅱ電轉(zhuǎn)入B.subtilisWS9感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含有四環(huán)素抗生素(30 mg/L)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～12 h 后挑取3～5個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取并酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功后的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵24 h后測(cè)定發(fā)酵上清液及破壁上清液的酶活，同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3oNPG水解酶活力測(cè)定

取一定稀釋倍數(shù)的酶液100 μL，加入1.8 mL的pH為5.0的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鈉緩沖液(50 mmol/L，下同)中，并于50 ℃水浴鍋中保溫5 min后加入100 μL的底物鄰硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷(2-nitrophenyl beta-D-galactopyranoside，oNPG)(20 mmol/L)，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后加入1 mL的Na2CO3(1 mol/L)終止反應(yīng)并顯色，在420 nm處測(cè)定溶液吸光值，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，β-半乳糖苷酶每分鐘催化oNPG分解產(chǎn)生1 μmoloNP所需的酶量定義為1個(gè)活力單位。

1.2.4 最適pH、溫度及pH、溫度穩(wěn)定性

為檢測(cè)重組β-半乳糖苷酶的最適pH及溫度，首先在50 ℃下檢測(cè)不同pH(3.0～9.0)的酶活力，以最高酶活力為100%，計(jì)算各pH下的相對(duì)活力。在尋找到最適pH后，在該pH下檢測(cè)不同溫度(30～70 ℃)的酶活力，同樣以最高酶活力為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)活力。

為檢測(cè)重組β-半乳糖苷酶的pH及溫度穩(wěn)定性，將酶液置于一定pH梯度(3.0～7.0)的緩沖液中并在4 ℃下靜置，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)量其殘余酶活力，以初始酶活力為100%，計(jì)算各取樣時(shí)間下的相對(duì)活力。為測(cè)量其溫度穩(wěn)定性，將酶液置于一定溫度梯度(40～60 ℃)的水浴鍋中，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)量其殘余酶活力，以初始酶活力為100%，計(jì)算各取樣時(shí)間下的相對(duì)活力。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

為滿足工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，對(duì)重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ搖瓶發(fā)酵進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，首先選取11種氮源替代TB中的蛋白胨及酵母粉，進(jìn)行氮源種類優(yōu)化，分別為：酵母浸膏、魚粉蛋白胨、牛肉蛋白胨、棉籽粉、牛肉浸膏、玉米漿干粉、大豆蛋白胨、豬骨蛋白胨、牛肉粉、安琪酵母粉、豆粕粉；優(yōu)化后選取較好的4種氮源進(jìn)行氮源濃度優(yōu)化；再根據(jù)優(yōu)化結(jié)果選取2種氮源進(jìn)行復(fù)合氮源的濃度及配比優(yōu)化，最終確定重組β-半乳糖苷酶的搖瓶發(fā)酵最佳復(fù)合氮源及其配比，每種優(yōu)化結(jié)果均以酶活力測(cè)定及SDS-PAGE分析來確定。

1.2.6 3-L罐放大培養(yǎng)及優(yōu)化

3-L罐的初始裝液量為900 mL，基礎(chǔ)培養(yǎng)基及初始參數(shù)設(shè)置見1.1.2.2培養(yǎng)條件。接種量為100 mL種子液，待溶氧反彈后開始補(bǔ)料，之后每隔4 h取1次樣，測(cè)定菌體的OD600值及酶活力。同時(shí)在3-L罐上進(jìn)行發(fā)酵溫度的優(yōu)化，除設(shè)置33、37 ℃兩個(gè)發(fā)酵溫度外，其余所有參數(shù)均一致。

1.2.7 制備GOS的研究

以pH 5.0的磷酸緩沖液溶解乳糖制成質(zhì)量濃度為400 g/L的底物，取10 mL底物于50 mL離心管中并置于水浴搖床(設(shè)置參數(shù)：50 ℃、150 r/min)中溫育10 min，加入酶液至終體系中酶活力為 5 U/mL，反應(yīng)8 h左右。酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過沸水浴10 min后12 000 r/min離心2 min去除蛋白，取上清液稀釋20倍后通過HPLC檢測(cè)并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.2.8 低聚半乳糖含量的檢測(cè)

二糖的檢測(cè)：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Thermo Aps-2 HYPERSIL (4.6 mm×250 mm)，示差檢測(cè)器Agilent 2410；流動(dòng)相為80%(體積分?jǐn)?shù))乙腈/水溶液，流速和柱溫分別設(shè)置為0.8 mL/min和35 ℃。

低聚半乳糖中的三糖、四糖、五糖以及乳糖和單糖的檢測(cè)：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Hi-Plex Ca(300 mm×7.7 mm)，示差檢測(cè)器Agilent 2410；流動(dòng)相為純水，流速和柱溫分別為0.5 mL/min和80 ℃。

GOS產(chǎn)率的計(jì)算如公式(1)所示[16]：

(1)

式中：低聚半乳糖為異乳糖、半乳二糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖等更高聚合度的寡糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的表達(dá)

將構(gòu)建好的重組載體pHY300PLK-β-Gal-Ⅱ轉(zhuǎn)入到B.subtilisWS9中，獲得重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ。經(jīng)搖瓶發(fā)酵24 h后，測(cè)得重組菌的OD600值為7.72，取648 μL的菌體進(jìn)行離心并用1 mL磷酸緩沖液進(jìn)行復(fù)溶后破壁，離心獲得破壁上清液及破壁沉淀。將重組菌的發(fā)酵上清液、破壁上清液、破壁沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析后發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵上清液、破壁上清液的91.5 kDa(β-Gal-Ⅱ的理論蛋白分子質(zhì)量)處均有明顯的蛋白條帶(圖1)，表明β-半乳糖苷酶在B.subtilisWS9中可以正常表達(dá)，且在無信號(hào)肽的情況下可以分泌至胞外，這可能是通過BENDTSEN等[17]的研究中提到的B.subtilis中存在的一種非典型分泌途徑進(jìn)行分泌的。測(cè)得發(fā)酵上清液和破壁上清液的酶活力分別為1.98、1.65 U/mL。

M-蛋白質(zhì)Marker；1-發(fā)酵上清液；2-破壁上清液；3-破壁沉淀

2.2 重組β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ酶學(xué)性質(zhì)

在不同pH、溫度下測(cè)定重組β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ 粗酶液的酶活力以獲得其最適pH、溫度及pH、溫度穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。重組β-半乳糖苷酶的最適pH為5.0，當(dāng)pH低于5.0時(shí)酶活力急劇下降，在pH 5.0～9.0酶活力變化較小。重組β-半乳糖苷酶的酶活力隨溫度的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在60℃達(dá)到酶活力最高點(diǎn)，當(dāng)溫度上升到70 ℃時(shí)，酶活力幾乎完全喪失，可能是由于高溫破壞了蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其失活。當(dāng)pH在5.0～7.0，該酶具有很好的pH穩(wěn)定性，放置24 h后的酶活力依舊可以保持在95%以上，而在pH 3.0和pH 4.0的條件下，該酶很快失活，3 h 降至初始酶活力的30%和50%左右。該酶在 40 ℃ 下具有很好的熱穩(wěn)定性，放置24 h后依舊能保持95%以上的活性，在50 ℃下，3 h左右酶活力降至初始酶活力的53.4%，而在60 ℃下，30 min幾乎喪失所有酶活力(圖2中未體現(xiàn))，僅剩初始酶活力的2.35%。

a-pH對(duì)重組β-Gal-Ⅱ酶活力的影響；b-溫度對(duì)重組β-Gal-Ⅱ酶活力的影響；c-重組β-Gal-Ⅱ的pH穩(wěn)定性；d-重組β-Gal-Ⅱ的熱穩(wěn)定性

2.3 重組β-半乳糖苷酶制備GOS

不同來源的β-半乳糖苷酶制備GOS的能力往往有著較大的差異，何乃瑩等[18]對(duì)一些不同來源的β-半乳糖苷酶制備GOS的條件及轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了整理，多數(shù)野生型酶及突變體的轉(zhuǎn)化率低于50%，轉(zhuǎn)化率低一直是亟待解決的問題。我們對(duì)該重組β-半乳糖苷酶進(jìn)行了GOS制備的研究，在底物乳糖質(zhì)量濃度為40 g/L的條件下，研究了不同溫度對(duì)該酶制備GOS的影響，結(jié)果如圖3所示，在50 ℃下反應(yīng)8 h轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)60.32%，隨著溫度的升高可以更早的達(dá)到轉(zhuǎn)化率的最大值，但高于50 ℃后最高轉(zhuǎn)化率略有降低，可能是由于高溫使得酶有一部分失活從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率偏低。

a-氨基柱(黑色)：1-葡萄糖；2-轉(zhuǎn)移二糖；3-乳糖；4-異乳糖；鈣柱(紅色)：1-四糖；2-三糖；3-二糖；4-葡萄糖；5-半乳糖；b-不同溫度下的β-半乳糖苷酶總轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化

2.4 重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ搖瓶發(fā)酵優(yōu)化

該重組β-半乳糖苷酶的最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)60%左右，高于很多商品酶，且反應(yīng)時(shí)間較短僅需要8 h左右即可達(dá)到轉(zhuǎn)化率的最高點(diǎn)，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。但目前的該酶催化制備GOS加酶量為5 U/mL，而TB搖瓶發(fā)酵酶活力僅為4.55 U/mL，且該培養(yǎng)基成本過高，所以為了提高重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的表達(dá)水平，以進(jìn)一步降低工業(yè)化應(yīng)用的用酶成本，需要對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化以提高表達(dá)水平。

本研究主要針對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源種類、濃度及復(fù)合氮源濃度及配比進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳發(fā)酵氮源。鑒于搖瓶發(fā)酵具有周期短，便于操作等優(yōu)點(diǎn)，首先在搖瓶中選用了11中不同的氮源替換TB中的酵母粉及蛋白胨，在相同條件下培養(yǎng)24 h后通過檢測(cè)發(fā)酵上清液、破壁上清液的酶活力以及SDS-PAGE分析不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖4-a、圖4-d、圖4-g所示。魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、玉米漿干粉、安琪酵母粉是較好的4種氮源，故選取這4種氮源繼續(xù)進(jìn)行氮源濃度的優(yōu)化。在氮源總質(zhì)量濃度為20、28、36、40 g/L的梯度下進(jìn)行，結(jié)果如圖4-b、圖4-e、圖4-h所示。由于玉米漿干粉高濃度時(shí)在培養(yǎng)基中不能完全溶解，存在大量沉淀，對(duì)OD600值的檢測(cè)具有較大的影響，故玉米漿干粉單獨(dú)做氮源未檢測(cè)破壁上清液的酶活力。結(jié)果顯示，牛肉浸膏、安琪酵母粉、玉米漿干粉質(zhì)量濃度分別為28、20、28 g/L時(shí)有利于β-半乳糖苷酶的表達(dá)，但由于牛肉浸膏價(jià)格昂貴，考慮工業(yè)化生產(chǎn)的成本問題，后續(xù)繼續(xù)選擇安琪酵母粉和玉米漿干粉進(jìn)行復(fù)合氮源的濃度及配比優(yōu)化，結(jié)果如圖4-c、圖4-f、圖4-i所示。在嘗試了不同濃度的配比之后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)安琪酵母粉和玉米漿干粉均為7.5 g/L時(shí)，最有利于β-半乳糖苷酶的表達(dá)，此時(shí)的搖瓶總酶活力最高，可達(dá)6.82 U/mL，是TB發(fā)酵的1.5倍，單一氮源發(fā)酵的2～2.5倍。

M-蛋白質(zhì)Marker；a、d、g-TB及11種氮源的搖瓶發(fā)酵結(jié)果(泳道1～12與a圖中橫坐標(biāo)一一對(duì)應(yīng))；b、e、h-4種氮源不同濃度的搖瓶發(fā)酵結(jié)果(e中的1～4、5～8、9～12分別對(duì)應(yīng)魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、安琪酵母粉質(zhì)量濃度為20、28、36、40 g/L，h中的1～4、5～8、9～12分別對(duì)應(yīng)牛肉浸膏、安琪酵母粉、玉米漿干粉質(zhì)量濃度為20、28、36、40 g/L)；c、f、i-復(fù)合氮源濃度及配比的搖瓶發(fā)酵結(jié)果(泳道1～12與c圖中橫坐標(biāo)一一對(duì)應(yīng))

2.5 重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的3-L發(fā)酵

劉動(dòng)斌等[19]曾將SulfolobussolfataricusP2來源的β-半乳糖苷酶在B.subtilisWS9中異源表達(dá)并進(jìn)行了3-L罐的高密度發(fā)酵，最終酶活力可達(dá)76.5 U/mL，但酶的使用成本依舊過高。本研究在搖瓶水平對(duì)重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的發(fā)酵培養(yǎng)基氮源進(jìn)行了優(yōu)化，成功將酶活力提高到了TB培養(yǎng)基的1.5倍，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力，故進(jìn)行3-L罐的放大培養(yǎng)。由于微生物發(fā)酵需要在一定的溫度下進(jìn)行，過高過低均不利于微生物的生長及酶的表達(dá)，鑒于前人的經(jīng)驗(yàn)，選擇在3-L罐上采用33、37 ℃兩種溫度進(jìn)行發(fā)酵，菌體的OD600值和酶活力隨時(shí)間的變化如圖5所示。由圖5-a可知，在這兩種發(fā)酵溫度下，菌體的OD600值變化基本一致，在發(fā)酵84 h左右均達(dá)到最高值，且均在120左右。但由圖5-b可知，37 ℃發(fā)酵下的最高酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于33 ℃下發(fā)酵的酶活力，并且SDS-PAGE分析結(jié)果也顯示37℃發(fā)酵下的目的蛋白條帶要粗于33 ℃發(fā)酵下的目的蛋白條帶(圖5-c～圖5-f)。在37 ℃發(fā)酵下的最高酶活力可達(dá)138.29 U/mL(目的蛋白含量達(dá)8.87 mg/mL)，是搖瓶發(fā)酵酶活力(6.82 U/mL)的20.3倍，成功實(shí)現(xiàn)了從搖瓶到3-L的放大培養(yǎng)，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

1～14-發(fā)酵26、30、34、40、44、52、56、60、63、68、72、76、80、84 h樣品a-3-L罐33、37 ℃發(fā)酵菌體OD600值隨時(shí)間變化曲線；b-3-L罐33、37 ℃發(fā)酵總酶活力隨時(shí)間變化曲線；c-37 ℃發(fā)酵上清液；d-33 ℃發(fā)酵上清液；e-37 ℃破壁上清液；f-33 ℃破壁上清液

3 結(jié)論

本研究成功將B.circulans來源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ在B.SubtilisWS9中進(jìn)行了異源表達(dá)，其最適pH及溫度分別為5.0和60 ℃，該酶在pH 5.0～7.0 具有很好的pH穩(wěn)定性，在40 ℃下具有很好的熱穩(wěn)定性，50 ℃下3 h左右降至初始酶活力的53.4%，60 ℃下30 min 該酶就幾乎完全喪失活性。在以40 g/L 乳糖為底物進(jìn)行GOS制備時(shí)，50 ℃下的轉(zhuǎn)化率略高于40 ℃和60 ℃，反應(yīng)8 h的GOS得率可達(dá)60.32%。由于其具有優(yōu)秀的GOS制備能力，所以為了提高重組菌株WS9-β-Gal-Ⅱ的表達(dá)水平從而降低工業(yè)化生產(chǎn)的成本，首先在搖瓶進(jìn)行了培養(yǎng)基氮源種類、濃度以及復(fù)合氮源的濃度及配比優(yōu)化，最終在氮源為安琪酵母粉7.5 g/L+玉米漿干粉7.5 g/L時(shí)搖瓶表達(dá)水平最高，酶活力達(dá)6.82 U/mL，是TB培養(yǎng)基發(fā)酵的1.5倍，是單一氮源發(fā)酵的2～2.5倍。根據(jù)優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行了3-L罐的放大培養(yǎng)，并同時(shí)進(jìn)行了33、37 ℃的發(fā)酵溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在這兩種發(fā)酵溫度下的菌體的生長濃度并無差別，但37 ℃發(fā)酵下的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于33 ℃，最高酶活力可達(dá)138.29 U/mL，是搖瓶發(fā)酵的20.3倍，成功實(shí)現(xiàn)了從搖瓶到3-L的放大培養(yǎng)，為GOS的規(guī)?；苽涮峁┝嗣钢苿┌l(fā)酵的技術(shù)基礎(chǔ)。