朱麗萍,孫丹焱,林曉虎,黃菊文,2,李光明,2,徐竟成,2

(1.同濟大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；2.長江水環(huán)境教育部重點實驗室，上海 200092)

當(dāng)前我國湖泊及城市緩流河道富營養(yǎng)化仍十分嚴(yán)重，藻類頻繁爆發(fā)導(dǎo)致水體光補償層變淺、透明度降低、活性藻毒素含量增加[1]，對生態(tài)環(huán)境和飲用水安全造成威脅[2]。作為重要的初級生產(chǎn)者，沉水植物在抑制藻類生長和修復(fù)水體生態(tài)方面均具有廣闊的應(yīng)用價值[3]，其生理結(jié)構(gòu)獨特，根、莖、葉均可有效吸收營養(yǎng)物質(zhì)[4]，且能夠通過化感作用影響鄰近藻類生長，保持自身生存優(yōu)勢。

化感作用是植物(及微生物)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物影響生物系統(tǒng)中物種生長和發(fā)展的過程[5]，本文主要指與周圍生物進(jìn)行信息傳遞與相互作用、調(diào)節(jié)不利因素脅迫的機制。早在1949年，Hasler等[6]便發(fā)現(xiàn)，有眼子菜生長的淺水湖泊里藻類數(shù)量明顯較低，并首次提出水生植物具有特殊抑藻作用。隨著水污染加劇、水體富營養(yǎng)化情勢嚴(yán)峻，在尋找持久、低毒的生物治理藻類生態(tài)控制方法的過程中，揭示大型水生植物化感抑藻原理的研究逐漸引起科研人員的重視。

當(dāng)前對沉水植物化感作用的研究已取得一定進(jìn)展，但還缺乏對不同樣本化感物質(zhì)檢測結(jié)果的差異性比較及對化感物質(zhì)特殊作用模式的系統(tǒng)總結(jié)，而此二者對于沉水植物水生態(tài)修復(fù)、保育的實踐具有重要意義。因此，本文嘗試從化感物質(zhì)成分分析與抑藻機理入手，詳細(xì)介紹化感物質(zhì)五種特殊作用模式，以期為未來研究及工程實踐中優(yōu)化沉水植物的類型、數(shù)量及應(yīng)用策略提供一定借鑒意義。

1 沉水植物主要化感抑藻物質(zhì)

化感物質(zhì)作為化感作用重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，其分離實驗始于上世紀(jì)80年代。隨著分離與檢測技術(shù)的快速發(fā)展，目前已確定了諸多具體的化感物質(zhì)成分，大多是分子量較小、結(jié)構(gòu)簡單的次生代謝產(chǎn)物(酚類、萜類、有機酸、生物堿等)，部分研究結(jié)果見表1。

表1 部分常見沉水植物化感物質(zhì)Table 1 Allelochemicals of some common submerged macrophytes

同時，沉水植物化感物質(zhì)通常從植物本體、植物種植水、沉水植物與藻類共同培養(yǎng)體系(下文簡稱草藻共培養(yǎng)體系)水樣三種樣本中提取，具體成分的檢測結(jié)果隨樣本種類、實驗條件等的變化而有所不同。

1.1 沉水植物本體化感物質(zhì)成分分析

Gross等[16]采用水、甲醇、丙酮幾種溶劑及其混合物分別進(jìn)行了沉水植物化感物質(zhì)提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有中度親脂性的溶劑(如50%v/v丙酮或70%v/v甲醇)提取到的物質(zhì)抑藻效應(yīng)最好，證明了化感物質(zhì)多具有中度親油性和一定的水溶性。Xian等[17]在研究金魚藻對銅綠微囊藻的化感作用時，將清洗后的新鮮植物直接提取揮發(fā)物或進(jìn)行風(fēng)干研磨，而后均采用0.05%的DMSO溶劑(二甲基亞砜，已被證明此濃度下不會對藻類生長造成影響)提取其中的高脂肪族化合物，檢測得出其主要成分為脂類化合物、萜類化合物、酚類化合物和鄰苯二甲酸酯類化合物。

面向植物本體進(jìn)行化感物質(zhì)提取、分離、檢測是最直接、最基礎(chǔ)的方式，可以最大限度排除其他外界物質(zhì)的干擾，但鑒定出的具有抑藻活性的物質(zhì)經(jīng)植物產(chǎn)生后是否被釋放到水環(huán)境中、釋放量的多少，以及在實際抑藻中發(fā)揮作用的大小都較難明確。

1.2 沉水植物種植水化感物質(zhì)成分分析

基于上述問題，有研究人員認(rèn)為水環(huán)境作為化感物質(zhì)轉(zhuǎn)運和作用的媒介，從沉水植物種植水或水浸提液中提取化感物質(zhì)進(jìn)行分析可能更加科學(xué)。例如有研究對比了金魚藻本身與種植水中的化感物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)前者含有較強的酚酸類抑藻物質(zhì)，在后者中則沒有檢出[18]。但水體中化感物質(zhì)濃度很低，往往需要多種技術(shù)聯(lián)用才能夠從其復(fù)雜的有機和無機化合物基質(zhì)中進(jìn)行化感物質(zhì)的識別、富集、分離和鑒定，如黃新穎等[19]先后通過過濾、固相萃取、乙酸乙酯液相萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮氣流吹脫等步驟，才利用GC-MS技術(shù)檢測得出以醇、脂肪酸、酚酸、羥基酸為主的21種化感物質(zhì)，必要時甚至需要人工合成某些典型物質(zhì)以進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)驗證和生物測試[18]。

然而種植水化感物質(zhì)成分分析也存在一定的問題，如實際水體環(huán)境藻類脅迫作用下，沉水植物釋放的化感物質(zhì)種類及含量是否有變化仍需進(jìn)一步探究。

1.3 草藻共培養(yǎng)體系化感物質(zhì)成分分析

雖然與種植水中化感物質(zhì)成分分析的方法基本一致，但由于存在沉水植物與藻類在光、營養(yǎng)等方面的競爭作用，草藻共培養(yǎng)體系本身不能直接證明由化感作用引發(fā)抑藻效果[16]，且無法證明水中物質(zhì)來源是植物還是藻類。許多研究優(yōu)化條件設(shè)計試圖消除光照、營養(yǎng)等干擾因素的脅迫，如控制光照和連續(xù)補充營養(yǎng)元素以保持系統(tǒng)中的氮磷恒定，然而這往往會降低植物化感物質(zhì)的分泌和釋放，導(dǎo)致實驗結(jié)果偏離實際情況。徐潔等[20]通過固相萃取、甲醇洗脫以及高效液相色譜分析得出，金魚藻在有無銅綠微囊藻共同培養(yǎng)的實驗中釋放的化感物質(zhì)組成不同，藻類脅迫會導(dǎo)致檢測結(jié)果強極性物質(zhì)含量下降、弱極性物質(zhì)含量增加。而藻類與植物釋放物質(zhì)的區(qū)分顯然需要補充各自單獨培養(yǎng)條件下的水中成分檢測并進(jìn)行對比分析才能得出。

2 沉水植物化感抑藻機理分析

沉水植物化感物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境的方式主要包括根系滲出和揮發(fā)、淋洗等[21]，其化感活性取決于植物產(chǎn)生量和釋放頻次[22]、自身特定的毒理學(xué)機制[23]以及目標(biāo)藻類的敏感性[24]，具有作用快、選擇性強、有效作用濃度低等優(yōu)點[18]。目前研究得出沉水植物化感物質(zhì)抑藻作用機理示意(以藍(lán)藻細(xì)胞為例)見圖1，主要包括抑制浮游藻類光合作用、造成浮游藻類氧化損傷、影響浮游藻類及其他生理生化過程等。

圖1 沉水植物化感抑藻物質(zhì)主要作用部位及影響(以藍(lán)藻細(xì)胞為例)Fig.1 The main action sites and effects of submerged plant allelopathic algae inhibitors (taking cyanobacteria cells as an example)說明：非化感物質(zhì)主要抑制位點的部分細(xì)微結(jié)構(gòu)未在圖中繪制和標(biāo)注

2.1 抑制浮游藻類光合作用

光合作用是植物重要的代謝活動，也是生態(tài)系統(tǒng)賴以生存的基礎(chǔ)。降低光合效率可以有效抑制藻類生物量增加，是化感抑藻主要機理之一。首先，化感物質(zhì)會影響對環(huán)境波動較為敏感的光系統(tǒng) Ⅱ(PSII)。朱俊英等[21]在進(jìn)行草藻共培養(yǎng)實驗時分析了銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)葉綠素含量，以及有效量子效率(YII)、最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)，結(jié)果表明處理組銅綠微囊藻光合能力明顯下降，PSII為作用位點之一。其次，陳國元等[25]發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻葉綠素a含量顯著降低的時間明顯早于生物量急降的時間，表明化感物質(zhì)會抑制光合色素合成或?qū)ζ湓斐善茐?。Zhu等[13]也通過脈沖幅度調(diào)制熒光儀證明了化感物質(zhì)對藻類光合系統(tǒng)活性及電子傳遞鏈具有顯著抑制作用。

2.2 造成浮游藻類氧化損傷

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)能使藻細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡，是重要的保護酶[21]。當(dāng)藻類受到脅迫時，ROS會因為超過歧化能力而累積并抑制SOD和POD的活性。張庭廷等實驗中用酚酸類化感物質(zhì)處理水華魚腥藻(Anabaenaflos-aquae)以及蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞SOD活性先上升后下降，且下降速度與細(xì)胞受損情況呈正相關(guān)；膜脂過氧化分解產(chǎn)物丙二醛(MDA)在實驗初期升高、后期逐漸下降，推測化感物質(zhì)導(dǎo)致藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)解體后死亡[26]。魯志營[27]也發(fā)現(xiàn)焦性沒食子酸能夠顯著誘導(dǎo)銅綠微囊藻的胞內(nèi)ROS累積并造成DNA斷鏈，同時ROS水平升高會導(dǎo)致半胱氨酰天冬氨酸蛋白水解酶(即Caspase-3(like)酶)激活，觸發(fā)銅綠微囊藻細(xì)胞程序性死亡。

2.3 影響浮游藻類其他生理生化過程

除以上兩種主要作用途徑外，化感物質(zhì)也會對藻細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)、氮磷代謝和呼吸作用等其他生理生化過程產(chǎn)生影響。Wang等[28]采用流式細(xì)胞儀和熒光探針PI分析得出，高濃度化感物質(zhì)會顯著損傷細(xì)胞膜完整性并改變細(xì)胞內(nèi)部粒度?；形镔|(zhì)處理前期也會導(dǎo)致銅綠微囊藻呼吸速率明顯升高[29]，為藍(lán)藻適應(yīng)脅迫提供更多能量。鄧平[30]發(fā)現(xiàn)小茨藻(Najasminor)可明顯抑制斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)硝酸還原酶活性，增加其堿性磷酸酶活性，從而影響氮磷代謝。馬浩天等[31]實驗處理后的藻類可溶性蛋白含量下降，可溶性糖含量則明顯增加，認(rèn)為化感作用可能破壞了藻細(xì)胞蛋白合成機制并產(chǎn)生了用于增強抗氧化功能的糖類。劉輝[32]實驗結(jié)果表明，金魚藻處理組中銅綠微囊藻藻藍(lán)蛋白相關(guān)基因、細(xì)胞分裂蛋白、ATP酶表達(dá)量等均有下降，而與生命節(jié)律相關(guān)的基因、部分氧化還原酶基因表達(dá)上升。

3 沉水植物抑藻的特殊作用模式分析

3.1 毒物興奮效應(yīng)

較多研究表明，沉水植物化感物質(zhì)對藻類并非是完全的抑制作用，而是表現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的毒物興奮(Hormesis)效應(yīng)。相較于鮮有關(guān)注的促進(jìn)情況，抑制類實驗作為達(dá)到抑藻生態(tài)目的的重點研究更多，即超過某一毒性閾值后，隨著化感物質(zhì)濃度的增加，對藻類的抑制作用也逐漸增強。劉碧云[33]實驗中，含2.5,4.5,6.5,8.5 mg/L的焦性沒食子酸培養(yǎng)液中銅綠微囊藻Fv/Fm值分別為對照的93.9%,83.7%,66.3%和28.3%。魯志營[27]也發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻DNA斷鏈情況隨暴露環(huán)境中焦性沒食子酸濃度的升高而顯著增加。

鮮啟鳴等[34]認(rèn)為出現(xiàn)毒物興奮效應(yīng)是由于化感物質(zhì)作為植物的次生代謝產(chǎn)物，在低濃度時會被降解成易于為藻類所利用的物質(zhì)，故達(dá)到一定濃度后才能發(fā)揮抑制作用。張庭廷等[26]則發(fā)現(xiàn)酚酸類化感物質(zhì)在低濃度時影響了細(xì)胞膜通透性，使藻細(xì)胞易于吸收營養(yǎng)物質(zhì)，高濃度時導(dǎo)致細(xì)胞膜受損和細(xì)胞腫脹、破裂，從而抑制藻細(xì)胞生長。具體嚴(yán)謹(jǐn)?shù)亩纠韺W(xué)分析還有待深入。

3.2 持續(xù)作用

研究發(fā)現(xiàn)，如果將植物與藻類分別培養(yǎng)，通過向藻類培養(yǎng)液中外加植物種植水進(jìn)行抑藻實驗，穗狀狐尾藻密度需達(dá)到65 g/L才能有效抑制銅綠微囊藻生長，且少量多次添加效果要好于大量單次添加。而草藻共培養(yǎng)系統(tǒng)中，穗狀狐尾藻僅需1 g/L便可顯著抑藻[35]。由此分析，長期持續(xù)暴露下，沉水植物釋放的低濃度化感物質(zhì)的抑藻效果能得到顯著加強。

Nakai等[12]檢測了穗花狐尾藻8種化感物質(zhì)的每日釋放量，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)在水體中的濃度能夠長期保持在一定范圍內(nèi)甚至有所增加，直接證明了化感物質(zhì)的釋放是一個動態(tài)持續(xù)過程。孫雪梅等[36]則以焦性沒食子酸為對象，比較了低劑量多次暴露(0.25 mg/L×4次×5 d，間隔4 h)與單次暴露(5 mg/L) 下銅綠微囊藻的細(xì)胞密度、ROS水平及膜系統(tǒng)損傷情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前者累積暴露量僅為設(shè)計暴露量一半時就已超過單次暴露的抑藻水平，驗證了前述推斷。

因此條件允許的情況下，在實際水體中恢復(fù)沉水植物群落，充分發(fā)揮化感物質(zhì)產(chǎn)生和釋放的持續(xù)作用能使抑藻實踐取得更好的效果。

3.3 聯(lián)合作用

實驗系統(tǒng)中藻類與多種植物或多種化感物質(zhì)共存時，受抑制情況比單獨培養(yǎng)某種植物或單獨投加某種化感物質(zhì)更強。同時，實驗室生物急性毒性測試顯示單種純化感物質(zhì)有效抑藻劑量的EC50值約在0.65 ～ 5.5 mg/L之間[13]，而高云霓等[37]測得沉水植物釋放到水環(huán)境中的化感物質(zhì)濃度僅能達(dá)到μg/L的水平。通過上述研究都可間接推斷化感物質(zhì)相互之間應(yīng)該存在聯(lián)合作用，主要表現(xiàn)為加和或協(xié)同，即兩種或兩種以上物質(zhì)對生物體產(chǎn)生的影響等于或大于其單獨作用效果[38]。

化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的同類化感物質(zhì)之間聯(lián)合作用已被證實。Zhu等[13]將4種已知的多酚類化感物質(zhì)制備了不同組成和比例的混合物，利用TI模型分析它們對銅綠微囊藻的綜合影響，模型數(shù)值計算大于、等于和小于1分別指示拮抗、加和和協(xié)同效應(yīng)，實驗結(jié)果為0.36～0.49，表現(xiàn)為明顯的協(xié)同作用。不同類別的化感物質(zhì)間也存在聯(lián)合作用，有研究使用壬酸、N-苯基-1-萘胺和咖啡酸3種化感物質(zhì)制備等濃度比例混合物，其聯(lián)合毒性表現(xiàn)出顯著協(xié)同作用，具體效果與單種物質(zhì)抑藻活性及混合比例有關(guān)[39]。

綜上可得，憑借化感物質(zhì)不同種類、不同濃度比例的聯(lián)合作用，沉水植物可在降低單種活性物質(zhì)作用劑量的同時達(dá)到更好的抑藻效果[2]，這一作用對實際應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。

3.4 選擇特性

沉水植物化感作用對象具有選擇性，往往為特定的某一種或幾種目標(biāo)生物[8,40]。普遍認(rèn)為浮游藻類對化感物質(zhì)表現(xiàn)出不同的敏感性，藍(lán)藻受到的抑制最強，其次是硅藻，綠藻受影響較小[41-42]，這對以藍(lán)藻水華為主的富營養(yǎng)化水體較為有利。如姚遠(yuǎn)等[43]在20 d培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，苦草、金魚藻、狐尾藻處理的實驗組與空白組相比，藍(lán)藻比例明顯先下降后上升，硅藻相反，綠藻比例相對穩(wěn)定。這可能是由于藍(lán)藻作為原核生物進(jìn)化位較為低級[43]，導(dǎo)致化感物質(zhì)對其光合作用和電子傳遞活性的抑制更加強烈[13]。Sabine Hilt[42]認(rèn)為除卻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜特性、吸收機制以及目標(biāo)生理過程(如光合作用)敏感性的差異，藻類附生微生物的膜結(jié)構(gòu)或能源分配也有影響。另有研究認(rèn)為，藻類對化感物質(zhì)的敏感性還受到溫度[44]、pH等[45]因素的影響，因此選擇特性是否可按物種進(jìn)行評判仍有待驗證。

3.5 抗性特性

有研究認(rèn)為長期共存于同一生境中的浮游藻類可能經(jīng)由共同進(jìn)化和自然選擇，在個體遺傳水平和物種群落水平對沉水植物的化感物質(zhì)產(chǎn)生抗性[41-42]。Reigosa等[46]認(rèn)為，化感作用只能發(fā)生在不同棲息地的生物之間，如來自不同湖泊、溪流甚至不同地理區(qū)域，即同一生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的生物會彼此適應(yīng)，化感物質(zhì)很難發(fā)揮作用，此類觀點使得化感作用的原位重要性受到質(zhì)疑。

而Maarten等[41]研究了有無伊樂藻的生態(tài)系統(tǒng)中浮游植物群落對伊樂藻化感物質(zhì)耐受性的差別，在對浮游植物來說足夠長的培養(yǎng)周期(4～8周)后，兩系統(tǒng)中藻類群落對伊樂藻分泌物的敏感性并無明顯差異。原因可能是水體中多種沉水植物釋放了不同化感物質(zhì)，且彼此之間存在聯(lián)合作用，使得藻類抗性進(jìn)化受阻。類似的野外研究結(jié)果同樣表明，有害藻類對化感物質(zhì)的抗性產(chǎn)生并不顯著，加之沉水植物兼具的營養(yǎng)物質(zhì)吸收作用，利用沉水植物進(jìn)行抑藻仍有較大的應(yīng)用潛力和研究價值。

4 實踐應(yīng)用啟示

近年來，在受污染的淺水湖泊和城市內(nèi)河等緩流水體的環(huán)境修復(fù)和水質(zhì)保育中，沉水植物展現(xiàn)出重要的生態(tài)效應(yīng)，在控制藻華方面也發(fā)揮了較大的作用。有野外研究得出，即使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)充足，在夏季長達(dá)50 d的大規(guī)模培養(yǎng)期內(nèi)，伊樂藻足以化感控制浮游藻類生長，且后者并未進(jìn)化出對應(yīng)抗性，植物抑藻長期穩(wěn)定應(yīng)用頗具潛力[41]。在基本排除氣候、湖泊規(guī)模、群落組成和營養(yǎng)物質(zhì)濃度等條件的干擾下，沉水植物覆蓋率在3%～100%之間均顯示出不同程度的化感抑藻效應(yīng)，且隨覆蓋率的增加化感作用潛在影響增大[42]。

本研究團隊已成功將沉水植物應(yīng)用在淺水湖泊、城市景觀水體生態(tài)修復(fù)和水質(zhì)維護、污水廠再生水回用的城市河道水生態(tài)控制以及藻華預(yù)防的研究與工程實踐中，并取得了一定的成果。從研究與應(yīng)用層面而言，沉水植物對反映藻類最大光能轉(zhuǎn)化效率指標(biāo)Fv/Fm值的控制，以及對藻華的實際抑制都有顯著效果[47]。但對其抑藻機理的深入研究和分析表明，以化感作用為切入點，對于不同地區(qū)、不同水體、不同水質(zhì)特征，結(jié)合不同沉水植物的化感特征，依據(jù)水體實際情況選擇和搭配植物類別，構(gòu)建多樣化的植物修復(fù)環(huán)境，精細(xì)高效地發(fā)揮沉水植物的抑藻作用，仍有諸多細(xì)節(jié)值得深入思考與探索。

除此之外，由于水生植物培育具有生長周期長、管理復(fù)雜等問題，短時間內(nèi)重構(gòu)受污水體水生植物群落、實現(xiàn)其自然更新十分困難。同時植物釋放化感物質(zhì)過程、活性與作用效果受到多種因素不同程度的干擾，如水中氮磷等營養(yǎng)元素[16,48]、光照和微生物降解作用[42]、溫度與季節(jié)等[1]。針對這些問題，直接添加易于人工合成的化感活性物質(zhì)進(jìn)行抑藻也可納入考慮范圍內(nèi)。例如，向藻華狀態(tài)下的云南滇池水樣添加L-賴氨酸，可以使其藍(lán)藻生物量在2 d內(nèi)迅速減少69%～83%[49]。顯然，直接添加純凈化感物質(zhì)具有儲存、操作、管理優(yōu)勢，適用水體范圍更廣，限制因素更少，自然條件下生物降解性好[50]，但由于作用有效劑量明顯增大，是否會對水體生態(tài)安全造成威脅仍有待進(jìn)一步評估。

5 展望

針對沉水植物化感抑藻效應(yīng)，結(jié)合未來在水環(huán)境中更準(zhǔn)確高效地發(fā)揮其抑藻功能的需求，可以從以下方面進(jìn)一步研究探索科學(xué)原理與應(yīng)用策略。

(1)沉水植物的抑藻效果影響因素眾多，其化學(xué)及生物作用過程相對復(fù)雜，有必要應(yīng)用現(xiàn)代科技手段，在分子尺度和基因?qū)用鎸形镔|(zhì)作用機理及作用模式進(jìn)行深入探究。

(2)針對不同水體水質(zhì)特征及沉水植物化感特性，將沉水植物化感抑藻效應(yīng)研究拓展至群落和生態(tài)系統(tǒng)水平，為高效、低毒的原位抑藻技術(shù)推廣提供實現(xiàn)途徑和工程應(yīng)用策略。

(3)植物與藻類之間的化感作用是相互的，已有研究表明藻細(xì)胞釋放的藻毒素等活性物質(zhì)也會對沉水植物和生態(tài)系統(tǒng)其他生物產(chǎn)生毒害，化感物質(zhì)脅迫是否會加劇有毒物質(zhì)釋放造成二次污染尚未可知，因此有必要開展相應(yīng)的機理研究和生態(tài)安全性評價。