劉玉鳳,牛國(guó)超,鄭少華,趙 芝,張 剛,李哲麗
結(jié)腸癌為消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤,近年來(lái),隨著國(guó)民飲食習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)改變和人口老齡化趨勢(shì)發(fā)展,該病發(fā)生率逐年增長(zhǎng)[1-2]。結(jié)腸癌為臨床惡性程度較高的腫瘤疾病[3],及時(shí)鑒別診斷,明確其基因?qū)W方面的發(fā)病原因是后續(xù)靶向治療的基礎(chǔ)。隨著RNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了多種非編碼RNA異常表達(dá),并參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子RNA,通過(guò)結(jié)合mRNA的3' 非編碼區(qū),影響靶基因表達(dá),不僅可參與調(diào)控正常細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程,還在腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮至關(guān)重要作用[6-7]。有學(xué)者指出,miR-31在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài),與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。LncRNA是一類(lèi)具有多種調(diào)控功能的RNA分子,可作為分子海綿結(jié)合miRNA或染色質(zhì)修飾因子,調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[9-10]。相關(guān)研究指出,MEG3在多種腫瘤細(xì)胞中扮演抑癌基因[11]?;诖?,本研究觀(guān)察結(jié)腸良惡性病變患者LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)情況,并分析其與腫瘤惡性程度的關(guān)系,旨在探索結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制,為結(jié)腸癌靶向治療及新藥研發(fā)提供思路。
1.1一般資料 選取我院2017年5月—2020年6月收治的行外科手術(shù)治療的結(jié)腸癌60例作為觀(guān)察組,其中男40例,女20例;年齡33~77(55.17±9.84)歲;病灶大?。?~9(4.58±0.49)cm;臨床分期:Ⅰ期15例,Ⅱ期34例,Ⅲ期11例;病理類(lèi)型:黏液腺癌7例,管狀腺癌41例,印戒細(xì)胞癌8例,乳頭狀癌4例;部位:左半結(jié)腸27例,右半結(jié)腸26例,橫結(jié)腸7例。另選取同期收治結(jié)腸良性病變60例作為對(duì)照組,男42例,女18例;年齡34~78(56.24±11.78)歲;病灶大小:2~8(4.84±0.47)cm;病理類(lèi)型:結(jié)腸息肉45例,結(jié)腸腺瘤15例;部位:左半結(jié)腸30例,右半結(jié)腸26例,橫結(jié)腸4例。2組性別、年齡及病灶大小等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。
1.2病例選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí);術(shù)前未接受放化療及生物免疫治療;臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌、結(jié)腸多原發(fā)癌或息肉、腺瘤樣結(jié)腸癌;伴有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病者;合并心、肝、腎等重要器官?lài)?yán)重功能障礙者;合并Crohn's病、潰瘍性結(jié)腸炎等結(jié)腸疾病者;伴有其他惡性腫瘤者。
1.3方法
1.3.1LncRNA MEG3、miR-31檢測(cè):分別取100 mg的凍存結(jié)腸癌組織、結(jié)腸良性病變組織置于研磨器中,加入1 ml Trizol試劑(上海澤葉生物科技有限公司),將研磨器放置于液氮中將組織磨成粉末狀,裂解細(xì)胞并以等體積異丙醇(上海羽朵生物科技有限公司)沉淀后,提取RNA;75%乙醇(中國(guó)北京基尼亞生物技術(shù)有限公司)清洗RNA沉淀,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及純度;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(BIOMIGA公司)合成樣品cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆?;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(BIOMIGA公司)擴(kuò)增LncRNA MEG3、miR-31基因,以β-actin作為內(nèi)參,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min 共40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,反應(yīng)結(jié)束后,在計(jì)算機(jī)軟件中獲取相應(yīng)PCR擴(kuò)增曲線(xiàn),得到各反應(yīng)管循環(huán)閾值;以2-ΔΔCt法分析,ΔΔCt=(樣本Ct均值-內(nèi)參Ct均值)-(對(duì)照樣品Ct均值-該樣品內(nèi)參Ct均值),以2-ΔΔCt表示樣品中目的基因LncRNA MEG3、miR-31相對(duì)表達(dá)量。
1.3.2增殖、侵襲基因檢測(cè):分別取結(jié)腸癌組織標(biāo)本,按照“1.3.1”相同步驟,檢測(cè)其增殖基因hTERT、SphK1與侵襲基因LIMK1、PRDX1表達(dá)量。
1.3.3治療及預(yù)后:結(jié)腸癌患者均接受根治性手術(shù)治療,并進(jìn)行為期1年隨訪(fǎng),每3個(gè)月門(mén)診復(fù)查1次,隨訪(fǎng)終點(diǎn)為腫瘤復(fù)發(fā),對(duì)于疑似復(fù)發(fā)患者實(shí)施穿刺活檢,確認(rèn)其是否復(fù)發(fā)。
1.4觀(guān)察指標(biāo) 比較2組LncRNA MEG3、miR-31表達(dá),評(píng)價(jià)LncRNA MEG3、miR-31對(duì)結(jié)腸良惡性病變的鑒別診斷價(jià)值,分析結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與增殖基因、侵襲基因的相關(guān)性,并比較不同LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)的結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)情況。
2.1LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)水平比較 觀(guān)察組LncRNA MEG3表達(dá)低于對(duì)照組,miR-31表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。
表1 2組LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)水平比較
2.2LncRNA MEG3、miR-31對(duì)結(jié)腸良惡性病變的鑒別診斷價(jià)值 以觀(guān)察組結(jié)腸癌患者為陽(yáng)性樣本,對(duì)照組結(jié)腸良性病變患者為陰性樣本,繪制LncRNA MEG3、miR-31鑒別診斷結(jié)腸良惡性病變的ROC曲線(xiàn),結(jié)果顯示LncRNA MEG3、miR-31鑒別診斷結(jié)腸良惡性病變的AUC分別為0.809、0.777,應(yīng)用Logistic二元回歸擬合,返回預(yù)測(cè)概率logit(p),將其作為獨(dú)立檢驗(yàn)變量,構(gòu)建各指標(biāo)聯(lián)合診斷的AUC為0.931,較上述單一指標(biāo)鑒別診斷價(jià)值更高。見(jiàn)表2、圖1。
表2 LncRNA MEG3、miR-31對(duì)結(jié)腸良惡性病變的鑒別診斷價(jià)值
圖1 LncRNA MEG3、miR-31鑒別診斷結(jié)腸良惡性病變的ROC曲線(xiàn)
2.3結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3以截?cái)嘀?.00分為高表達(dá)組與低表達(dá)組,結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3高表達(dá)組增殖基因hTERT、SphK1與侵襲基因LIMK1、PRDX1表達(dá)水平均低于低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌患者癌組織LncRNA MEG3表達(dá)與hTERT、SphK1、LIMK1、PRDX1呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.632、-0.607、-0.615、-0.674,P<0.01)。
表3 結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性
2.4結(jié)腸癌組織中miR-31表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性 結(jié)腸癌患者miR-31以截?cái)嘀?.99分為高表達(dá)組與低表達(dá)組,結(jié)腸癌組織中miR-31高表達(dá)組增殖基因hTERT、SphK1與侵襲基因LIMK1、PRDX1表達(dá)水平均高于miR-31低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌患者癌組織miR-31表達(dá)與hTERT、SphK1、LIMK1、PRDX1呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.598、0.603、0.612、0.607,P<0.01)。
表4 結(jié)腸癌組織中miR-31表達(dá)與增殖、侵襲基因的相關(guān)性
2.5預(yù)后情況 結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3、miR-31以截?cái)嘀捣譃楦弑磉_(dá)組與低表達(dá)組,結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率為5.88%(1/17)低于LncRNA MEG3低表達(dá)組的23.26%(10/43),miR-31高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率為21.95%(9/41)高于miR-31低表達(dá)組的10.53%(2/19),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)腸癌發(fā)病過(guò)程是一個(gè)由多基因控制,分不同階段,長(zhǎng)期形成的復(fù)雜致病過(guò)程[12]。miRNA是一類(lèi)由18~23個(gè)核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子,主要功能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)以抑制翻譯和(或)促進(jìn)miRNA降解,其可調(diào)控>30%的基因組,可參與細(xì)胞增殖、分化、代謝等過(guò)程[13-14]。迄今為止,在人類(lèi)基因組中已發(fā)現(xiàn)500多個(gè)miRNA,均廣泛參與惡性腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖及凋亡等病理過(guò)程。近年來(lái),已發(fā)現(xiàn)多種miRNA存在于結(jié)腸癌中,并在其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,與結(jié)腸癌相關(guān)的miRNA逐漸被發(fā)現(xiàn),有研究指出,miR-31與結(jié)腸癌密切相關(guān)[15]。有學(xué)者指出,miR-31在結(jié)直腸癌中呈明顯高表達(dá)狀態(tài),且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者癌組織中miR-31表達(dá)量高于淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者[16]。進(jìn)一步研究顯示,轉(zhuǎn)染miR-31抑制劑可顯著降低LoVo細(xì)胞內(nèi)miR-31表達(dá),增加細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)細(xì)胞有絲分裂G2/M期停滯[17]。由此推測(cè),miR-31可能是結(jié)腸癌患者的一個(gè)潛在早期診斷標(biāo)志物,且抑制其表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌治療存在一定意義。本研究結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織miR-31表達(dá)高于結(jié)腸良性病變組織,提示miR-31可有效鑒別結(jié)腸良惡性病變,并可作為結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。
LncRNA作為繼miRNA后發(fā)現(xiàn)的在人類(lèi)疾病中發(fā)揮重要作用的非編碼RNA。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)LncRNA在腫瘤發(fā)生、演變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18-19]。LncRNA可在表觀(guān)遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后3個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá),其主要通過(guò)染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活或干擾等方式調(diào)控。MEG3作為小鼠母體印記基因GIt2的人類(lèi)同系物,是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的LncRNA。MEG3在多種人類(lèi)正常組織中呈高表達(dá)狀態(tài),尤其在腦及垂體中表達(dá)最高,但在多種腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)缺失或表達(dá)下降。已有研究證實(shí),MEG3可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞循環(huán)功能停滯,抑制癌細(xì)胞增殖及侵襲,并可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,阻礙腫瘤發(fā)生[20]。目前已有研究證實(shí),MEG3可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抑癌作用,如DNA甲基化、Rb途徑、p53途徑及影響血管新生等[21-22]。司君利等[23]證實(shí),MEG3在結(jié)腸癌中表達(dá)明顯下降,提示其在結(jié)腸癌中扮演著抑癌基因的角色,且相較于MEG3低表達(dá)者,高表達(dá)者中位生存期明顯延長(zhǎng),說(shuō)明其對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后具有潛在價(jià)值。本研究中,觀(guān)察組LncRNA MEG3表達(dá)低于對(duì)照組,且其診斷結(jié)腸癌的AUC為0.809,具有一定診斷價(jià)值,與上述研究結(jié)果相符。
增殖基因異常表達(dá)直接參與結(jié)腸癌發(fā)生,而侵襲基因異常表達(dá)為腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),故檢測(cè)癌組織增殖基因與侵襲基因可反映腫瘤惡性程度。hTERT、SphK1為典型增殖基因,其中hTERT作為端粒酶催化亞基重要組成部分,可激活端粒酶,致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖[24];SphK1活化后可生成S1P,抑制其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]。LIMK1、PRDX1為臨床常見(jiàn)侵襲基因,前者在腫瘤組織中呈高表達(dá),主要通過(guò)調(diào)控去磷酸化平衡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲;后者高表達(dá)可致腫瘤細(xì)胞抗氧化能力增強(qiáng),抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,并促使其增殖、轉(zhuǎn)移[26-27]。本研究結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3低表達(dá)組、miR-31高表達(dá)組hTERT、SphK1與LIMK1、PRDX1表達(dá)均高于LncRNA MEG3高表達(dá)組、miR-31低表達(dá)組,且相關(guān)性分析可知,LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)均與增殖基因、侵襲基因表達(dá)有明顯相關(guān)性,提示LncRNA MEG3低表達(dá)、miR-31高表達(dá)可直接促進(jìn)結(jié)腸癌癌細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移,臨床可通過(guò)檢測(cè)其表達(dá),明確腫瘤惡性程度,為臨床診療提供依據(jù)。此外,本研究結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率低于LncRNA MEG3低表達(dá)組,miR-31高表達(dá)組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率高于miR-31低表達(dá)組,提示LncRNA MEG3、miR-31表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后有關(guān),但本研究樣本量較小,且隨訪(fǎng)時(shí)間較短,有待臨床擴(kuò)大樣本量,延長(zhǎng)隨訪(fǎng)時(shí)間進(jìn)一步證實(shí)。
綜上所述,結(jié)腸癌患者LncRNA MEG3低表達(dá)、miR-31高表達(dá),且二者表達(dá)與腫瘤惡性程度有關(guān),臨床檢測(cè)LncRNA MEG3、miR-31可用于鑒別診斷結(jié)腸良惡性腫瘤,明確腫瘤惡性程度,為臨床診斷及靶向治療、新藥研發(fā)提供思路。