杜艷紅，譚 昊，聶建光，李洪媛，王小偉，陳思佳，李 曉，李婷婷

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

酒曲釀酒，是中國勞動(dòng)人民長期經(jīng)驗(yàn)的積累和智慧的結(jié)晶，酒曲的重要性可與我國四大發(fā)明媲美。酒曲是釀造傳統(tǒng)白酒重要的原料之一，素有“曲為酒之骨”之美譽(yù)。白酒品質(zhì)的好壞與酒曲是密不可分的。酒曲是以糧谷為主要原料，自然接種、開放式培養(yǎng)而成的物系、酶系、菌系三者共存的糖化發(fā)酵劑。白酒發(fā)酵實(shí)質(zhì)上是由多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果，酒曲是白酒發(fā)酵中微生物主要的來源。

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外有許多關(guān)于酒曲微生物多樣性的研究。高通量測序技術(shù)能更為準(zhǔn)確系統(tǒng)地對微生物的組成進(jìn)行分析，進(jìn)而更為客觀、全面的分析微生物的群落結(jié)構(gòu)。高通量測序技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于分析白酒等發(fā)酵食品的微生物群落組成。喬曉梅等采用高通量測序技術(shù)對冷季和熱季清香大曲真菌群落進(jìn)行分析，明晰了清香大曲主要真菌群落為米根霉、傘支犁頭霉、扣囊酵母、畢赤酵母，并解析了冷熱季真菌組成差異；薛宇昂等采用高通量測序技術(shù)對石花酒大曲中微生物多樣性進(jìn)行解析，確定了細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸菌屬等，優(yōu)勢真菌為復(fù)膜孢酵母屬、紅曲菌屬、熱子囊菌屬等，驗(yàn)證了細(xì)菌與真菌有一定的相關(guān)性；王勇等從牛欄山大曲中共獲得358 種原核生物OTU和69 種真核生物OTU，確證乳酸菌類群是大曲中優(yōu)勢原核生物，扣囊酵母和畢赤酵母為優(yōu)勢真核生物。

以上研究成果為大曲中優(yōu)勢微生物開發(fā)及進(jìn)一步深入的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。紅星大曲中微生物豐富，種類繁多，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有關(guān)紅星大曲微生物多樣性的研究相對較少。本研究以紅星大曲為研究對象，采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對紅心、后火、清茬及強(qiáng)化大曲微生物多樣性進(jìn)行測序，分析微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性，尋找各類型曲的主要差異，以期為紅星大曲微生物資源開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品

紅星大曲：采集自北京紅星股份有限公司，四類樣品分別命名為HQ（清茬曲）、HX（紅心曲）、HH（后火曲）、HJ（強(qiáng)化高溫曲）。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

DNA 提取試劑盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美國Omega Biotek 公 司；TransStart Fastpfu DNA Polymerase（TransGen AP221-02），北京全式金生物公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，AXYGEN 公司；GeneAmp?9700 型PCR 儀，美國ABI 公司；Quanti-Fluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，Promega 公司；Illumina Miseq 高通量測序平臺，美國Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將采集到的紅星大曲樣品粉碎后備用。

1.2.2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.? soil DNA kit 說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測定DNA濃度和純度。PCR反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性3 min(95 ℃)，變 性30 s (95 ℃)，退 火30 s (55 ℃)，延 伸45 s(72 ℃)，終延伸10 min(72 ℃)，細(xì)菌循環(huán)數(shù)為27，真菌為35。第二輪PCR 擴(kuò)增：以第一輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系同“第一輪擴(kuò)增”。使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物對細(xì)菌16S rRNA 基因V3—V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；使用ITS1F(55'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和ITS2R(55'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')引物對真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后使用2 %瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City,CA,USA) 進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus?Fluorometer(Promega,USA)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美國）進(jìn)行建庫：(1)接頭鏈接；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；(4)磁珠回收PCR 產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進(jìn)行拼接：

（1）過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp 以下的reads，去除含N堿基的reads；

（2）根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對reads 拼接(merge)成一條序列，最小overlap 長度為10 bp；

（3）拼接序列的overlap 區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；

（4）根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分樣品，調(diào)整序列方向，barcode 允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。

使用UPARSE軟件（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根據(jù)97 %的相似度對序列進(jìn)行OTU 聚類并剔除嵌合體；利用RDP classifier(http:// rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對數(shù)據(jù)庫；并利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger 云數(shù)據(jù)分析平臺進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群落豐度和多樣性分析

2.1.1 稀釋曲線分析

Shannon 指數(shù)曲線反映樣本中微生物的多樣性，利用各樣本測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。

如圖1、圖2 所示，隨著測序量的增加，物種的數(shù)量增加，Shannon曲線進(jìn)入了平緩期，表明物種數(shù)量已經(jīng)達(dá)到飽和，即便有新物種的產(chǎn)生，多樣性也不會隨著測序量的增加而發(fā)生變化。說明測序數(shù)據(jù)量已足夠大，可以反映樣品中絕大多數(shù)生物的物種信息。

圖1 真菌Shannon曲線

圖2 細(xì)菌Shannon曲線

2.1.2 真菌及細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

使用Illumian MiSeq 高通量測序技術(shù)對4 個(gè)紅星大曲的真菌及細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，ITS1測序結(jié)果及多樣性指數(shù)見表1，16S rRNA 測序結(jié)果及多樣性指數(shù)見表2。ACE 和Chao 指數(shù)是估算樣品中物種數(shù)目及所含OTU 數(shù)目的指數(shù)，反映樣品的物種豐度；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)用來表現(xiàn)樣品中物種的均勻度和豐富度，指數(shù)的高低會受均勻度影響，樣本中的物種分布越均勻，多樣性越高；Coverage反映樣本的測序飽和度。

表1 紅星大曲真菌多樣性指數(shù)對比

表2 紅星大曲細(xì)菌多樣性指數(shù)對比

由表1 可知，4 個(gè)紅星大曲樣品中共檢出224050條真菌序列，樣品高溫強(qiáng)化曲中真菌群落豐度最高，其次是紅心曲、清茬曲，后火曲群落豐度最低；樣品高溫強(qiáng)化曲多樣性最高，其次是后火曲、紅心曲，清茬曲多樣性最低。由表2 可知，4 個(gè)紅星大曲樣品中共檢出160589 條細(xì)菌序列，清茬曲中細(xì)菌群落豐度最高，其次是后火曲、紅心曲，高溫強(qiáng)化曲細(xì)菌群落豐度最低；樣品清茬曲細(xì)菌多樣性最高，其次是后火曲、紅心曲，高溫強(qiáng)化曲細(xì)菌群落多樣性最低。

2.1.3 Venn圖分析

Venn 圖可以統(tǒng)計(jì)多種樣品中獨(dú)有和共有的OTU 數(shù)，可直觀地顯示樣品OTU 數(shù)組成的相似性及重疊等情況，對于不同樣品之間獨(dú)有和共有的OTU數(shù)疊加，可得出OTU分布Venn圖。

由圖3 可知，4 個(gè)紅星大曲樣品中總共有真菌OTU 數(shù)目是151，樣品高溫強(qiáng)化曲中獨(dú)有的真菌OTU 數(shù)目是54，是4 個(gè)樣本中獨(dú)有數(shù)目最多的樣本，凸顯了該樣本微生物菌群的復(fù)雜性和特殊性。由圖4 可知，4 個(gè)紅星大曲樣品總共有細(xì)菌OTU 數(shù)目是471，樣品清茬曲中獨(dú)有的細(xì)菌OTU 數(shù)目是318，是4 個(gè)樣本中獨(dú)有數(shù)目最多的，凸顯了該樣本微生物菌群的復(fù)雜性和特殊性，樣品高溫強(qiáng)化曲的細(xì)菌獨(dú)有OTU 數(shù)目是32，凸顯了該樣本微生物菌群的特殊性。

圖3 真菌VENN圖分析

圖4 細(xì)菌VENN圖分析

2.2 基于屬水平的結(jié)構(gòu)分析

由圖5 可知，4 個(gè)樣品中共有優(yōu)勢真菌屬為復(fù)膜孢酵母屬（）、嗜熱子囊菌屬（）、威克漢姆酵母屬（）、曲霉屬（）和絲孢畢赤酵母屬（），平均相對含量分別為75.24 %、10.75%、4.91%、2.25%、1.78%和1.22%。

圖5 HH&HJ&HX&HQ共有真菌物種餅狀圖（屬水平）

由圖6 可知，清茬曲中主要優(yōu)勢真菌為復(fù)膜孢酵母屬，相對含量高達(dá)97.93 %，為絕對優(yōu)勢微生物。在紅心曲中優(yōu)勢真菌包括復(fù)膜孢酵母屬、嗜熱子囊菌、單端孢屬（）、曲霉屬，相對含量分別為：89.92 %、3.10 %、4.05 %、0.75 %。后火曲中優(yōu)勢真菌為復(fù)膜孢酵母、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬，相對含量分別為：85.31 %、7.19 %、7.12 %。高溫強(qiáng)化曲優(yōu)勢真菌為復(fù)膜孢酵母屬、嗜熱子囊菌屬、威克漢姆酵母屬、絲孢畢赤酵母屬、曲霉屬，相對含量分別為：27.91%、32.74%、18.16%、4.08%、1.14%。綜上，紅星4 種大曲樣品中優(yōu)勢真菌存在明顯差異。

圖6 樣品中真菌組成圖（屬水平）

由圖7 可知，4 個(gè)樣品中優(yōu)勢細(xì)菌屬為克羅彭斯特菌屬（）、鏈霉菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、葡萄球菌屬（）、乳桿菌屬（）、枝芽孢菌屬()、泛生菌屬（）、海洋芽孢桿菌屬（）和魏斯氏菌屬（），平均相對含量分別為34.16 %、21.52 %、13.06 %、5.02%、4.62%、4.06%、3.87%、3.50%和2.84%。

圖7 HH&HJ&HX&HQ共有細(xì)菌物種餅狀圖（屬水平）

由圖8 可知，清茬曲中優(yōu)勢細(xì)菌為鏈霉菌屬、克羅彭斯特菌屬、葡萄球菌屬、泛生菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬，相對含量分別為：22.76 %、19.43%、12.12%、10.69%、8.29%、7.17%。紅心曲中優(yōu)勢細(xì)菌為鏈霉菌屬、克羅彭斯特菌屬、葡萄球菌屬、海洋芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、塔式糖多孢菌屬（）、泛生菌屬，相對含量分別為62.46 %、9.64 %、6.65 %、5.51 %、3.44 %、3.20 %、3.08%。后火曲中主要優(yōu)勢細(xì)菌為芽孢桿菌屬、克羅彭斯特放線菌屬、塔式糖多孢菌屬、海洋芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬，相對含量分別為42.0 %、29.12 %、13.72 %、9.99 %、1.09 %。高溫強(qiáng)化曲主要優(yōu)勢細(xì)菌為克羅彭斯特菌屬、枝芽孢菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬，相對含量分別為78.44 %、10.55%、6.72%、2.99%。綜上，紅星大曲樣品中優(yōu)勢細(xì)菌存在明顯差異。

圖8 樣品中細(xì)菌組成圖（屬水平）

2.3 樣品中真菌及細(xì)菌相似性分析

通過非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析群落間存在的關(guān)系，根據(jù)樣品中包含的物種信息，以點(diǎn)的形式反映在多維空間上，對不同樣品間的差異程度，則是最終通過點(diǎn)與點(diǎn)的距離表現(xiàn)在圖中，距離遠(yuǎn)近代表樣品中菌體群落的差異程度。

由圖9 可知，清茬曲、紅心曲和后火曲距離較近，聚集在圖的左側(cè)，群落差異較??；高溫強(qiáng)化曲的細(xì)菌微生物聚集在右側(cè)部分，距清茬曲、紅心曲和后火曲差異較大，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的組群。由圖10可知，層級聚類樹與NMDS 相似，4 種大曲共聚為兩大支，清茬曲、紅心曲和后火曲的真菌屬聚為一類，差異較小，其中紅心曲和后火曲真菌組成最為接近，高溫強(qiáng)化曲的真菌屬另聚為一類。

圖9 真菌非度量多維尺度分析（NMDS）

圖10 真菌基于Beta多樣性距離的樣品層級聚類樹

由圖11 可知，清茬曲和紅心曲距離較近，聚集在圖的右側(cè)，群落差異較??；高溫強(qiáng)化曲和后火曲的細(xì)菌微生物聚集在左側(cè)部分，距清茬曲和紅心曲較遠(yuǎn)，差異較大，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的組群。由圖12 可知，層級聚類樹與NMDS 相似，4 種大曲共聚為三類，清茬曲和紅心曲細(xì)菌屬聚為一類，差異較小，高溫強(qiáng)化曲和后火曲的細(xì)菌分別為一類。

圖11 細(xì)菌菌落非度量多維尺度分析（NMDS）

圖12 細(xì)菌基于Beta多樣性距離的樣品層級聚類樹

2.4 物種差異分析

Kruskal_Wallis 秩和檢驗(yàn)，是一個(gè)將兩個(gè)獨(dú)立樣本的wilcox 秩和檢驗(yàn)推廣到3 個(gè)或更多組檢驗(yàn)的方法，是多組（≥3）獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)的一種方法。該分析可以對多組樣本的物種進(jìn)行顯著性差異分析，縱軸表示某一分類水平下的物種名，物種對應(yīng)的每個(gè)柱子表示該物種在各樣本組中的平均相對豐度，不同顏色表示不同分組。最右邊為P值，*0.01＜P≤0.05，**0.001＜P≤0.01，***P≤0.001，用于觀測多物種在多組間的差異。

由圖13 可以看出，清茬曲與其他大曲真菌組成有顯著差異，優(yōu)勢真菌菌屬為復(fù)膜孢酵母屬和威克漢姆酵母屬，復(fù)膜孢酵母菌數(shù)含量高于其他大曲。紅心曲優(yōu)勢真菌菌屬為：復(fù)膜孢酵母菌屬、嗜熱子囊菌屬和單端孢菌屬，其中單端孢菌屬含量稍高于其他大曲。后火曲優(yōu)勢真菌菌屬為：復(fù)膜孢酵母菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬，其中曲霉屬含量高于其他樣品。強(qiáng)化高溫曲以復(fù)膜孢酵母菌屬、嗜熱子囊菌屬、威克漢姆酵母屬等為優(yōu)勢真菌，嗜熱子囊菌屬、威克漢姆酵母屬物種含量高于其他大曲，物種多樣性高，出現(xiàn)了德巴利酵母屬（）、雙足囊菌屬（）等特有物種。

圖13 真菌多物種差異檢驗(yàn)柱形圖

由圖14 可以看出，清茬曲與其他大曲細(xì)菌組成顯著差異，主要優(yōu)勢細(xì)菌菌屬為：克羅彭斯特菌屬、鏈霉菌屬、芽孢菌屬、葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、范球菌屬等，物種豐度和多樣性最高。紅心曲以克羅彭斯特菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、海洋芽孢桿菌屬等為主要優(yōu)勢細(xì)菌菌屬，其中鏈霉菌屬含量遠(yuǎn)高于其他菌屬。后火曲以克羅彭斯特菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、海洋芽孢桿菌屬為主要優(yōu)勢細(xì)菌菌屬，其中芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬含量高于其他樣品。高溫強(qiáng)化曲以克羅彭斯特菌屬、塔式糖多孢菌屬、魏斯氏菌屬為主要優(yōu)勢細(xì)菌菌屬，塔式糖多孢菌屬、魏斯氏菌屬含量遠(yuǎn)高于其他樣品。

圖14 細(xì)菌多物種差異檢驗(yàn)柱形圖

3 結(jié)論

本研究使用高通量測序技術(shù)，以真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）和細(xì)菌16S rRNA 的V3—V4 為測序靶點(diǎn)，分析紅星大曲中的真菌和細(xì)菌微生物多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅星大曲中的真菌主要由膜孢酵母屬（）、嗜熱子囊菌屬（）、威克漢姆酵母屬（）、曲霉屬（）和絲孢畢赤酵母屬（）5個(gè)屬組成；紅星大曲中的細(xì)菌主要由克羅彭斯特菌屬（）、鏈霉菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、葡萄球菌屬（）、乳桿菌屬（）、枝芽孢菌屬()、泛生菌屬（）、海洋芽孢桿菌屬（）和魏斯氏菌屬（）9 個(gè)屬組成。紅星強(qiáng)化高溫曲真菌菌落和細(xì)菌菌落與清茬曲、紅心曲和后火曲存在顯著差異。高溫強(qiáng)化曲增加了真菌組成的多樣性和豐度，除復(fù)膜孢酵母菌屬外，嗜熱子囊菌屬、威克漢姆酵母屬、絲孢酵母菌屬含量大幅提升；細(xì)菌組成以克羅彭斯特菌屬、塔式糖多孢菌屬、魏斯氏菌屬為主要優(yōu)勢細(xì)菌，塔式糖多孢菌屬、魏斯氏菌屬含量遠(yuǎn)高于其他樣品。紅心曲與后火曲的真菌菌落組成更為接近，清茬曲和紅心曲的細(xì)菌菌落更為接近。紅星強(qiáng)化高溫曲的真菌菌落組成豐度及多樣性增加對提升紅星清香大曲酒體風(fēng)味豐富度有正向貢獻(xiàn)，有待進(jìn)一步深入研究。本研究不僅為高通量測序技術(shù)在紅星白酒研究中的應(yīng)用積累數(shù)據(jù)，也為今后改善大曲質(zhì)量及綜合利用多種大曲微生物提供了理論研究指導(dǎo)。