李文舉羅福龍王鳳忠貫東艷范 蓓Alberto Carlos Pires Dias王 瓊鐘 武

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部,四川 瀘州 646000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193;3.葡萄牙米尼奧大學(xué)生物系,分子和環(huán)境生物學(xué)中心,中葡藥食植物資源研究中心,葡萄牙 布拉加 4710-057;4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中葡中醫(yī)藥國(guó)際合作中心,四川 瀘州 646000;5.四川省康復(fù)醫(yī)院,成都 611139)

膿毒癥(sepsis)是ICU常見(jiàn)重癥之一,因?yàn)槠淦鸩】?病死率高的特點(diǎn),目前已經(jīng)成為國(guó)際上討論的主要健康問(wèn)題[1]。在膿毒癥的疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,免疫調(diào)節(jié)失衡所導(dǎo)致的過(guò)度炎癥和免疫抑制狀態(tài)是導(dǎo)致多器官損傷的主要原因。目前主要以抗菌及多種支持治療方案管理膿毒癥患者,但長(zhǎng)期的侵入性檢查、治療易導(dǎo)致感染,包括抗生素的過(guò)度使用出現(xiàn)的耐藥性等副作用都在影響著膿毒癥的治療。因此,中藥結(jié)合抗生素方案逐漸成為膿毒癥臨床治療探索的策略之一[2-3]。

最新藥理學(xué)研究表明,金銀花(Lonicerae japonicaeflos)是一種具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗病毒及等功能的中草藥[4]。其復(fù)方制劑如痰熱清、熱毒寧及金銀花單體中部分成分被證明對(duì)膿毒癥炎癥抑制及免疫調(diào)節(jié)等有較好的輔助治療效果[5-6]。但目前對(duì)金銀花改善膿毒癥免疫狀態(tài)的機(jī)制研究較少,且由于金銀花成分復(fù)雜,二者相關(guān)結(jié)合研究存在困難。因此,我們首先使用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)金銀花水提物進(jìn)行成分分析。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)建膿毒癥細(xì)胞模型,進(jìn)而通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究金銀花改善膿毒癥的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。

1.2 主要試劑及儀器

金銀花產(chǎn)自山東,購(gòu)自北京太洋樹(shù)康藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)2008113),經(jīng)水提、濃縮、噴霧干燥、粉碎而成;DMEM培養(yǎng)基(Thermo Scientific,批號(hào)11965092);胎牛血清(Gibco,批號(hào):10099141);LPS(Sigma公司,批號(hào)12880);RNA提取試劑盒(艾德萊,批號(hào)RN28);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 批號(hào)A5000);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein,批號(hào):E096-01B)。細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo);酶標(biāo)儀(美國(guó),MolecμLar Devices);CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad);低溫高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司,型號(hào):5430R)。UPLC-QExactiveOrbitrap-MS四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司);超高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛,Ultimate3000);色譜柱LO90AC18(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 金銀花水提物成分檢測(cè)及活性靶點(diǎn)研究

(1)UPLC-QE-Orbitrap-MS分析金銀花水提物成分

精密移取金銀花提取物1 mg,用1 mL 70%甲醇溶解,超聲處理15 min,離心(1000 r/min,10 min),取上清,過(guò)微孔濾膜(0.22 μm),進(jìn)行超高效液質(zhì)(UPLC-QE-Orbitrap-MS)分 析。色 譜 柱 為Waters UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm);

流動(dòng)相A(甲酸水溶液:0.1%),B(甲酸乙腈溶液:0.1%);梯度洗脫條件為0～15 min:5% B→90% B;15 ～20 min:90% B,20 ～20.1:90% B→5% B,20.1～30 min:5% B;流速為0.3 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量為5 μL。該系統(tǒng)與QE Orbitrap質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Science)相連。電噴霧離子源,正、負(fù)離子切換全掃描(100～1500 Da掃描范圍),離子源溫度320℃,電離源電壓3.8 kV(+),輔助氣加熱溫度:350℃,分辨率70000,載氣為高純氮?dú)?鞘氣流速25 L/min,輔助氣流速8 L/min,碰撞能量15、30、45 eV。使用Compound Discoverer(2.1.0.401版)導(dǎo)入數(shù)據(jù),結(jié)合本地OTCML數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分預(yù)測(cè)。

(2)金銀花水提物活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)研究

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP:Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform)、Swiss靶點(diǎn)預(yù)測(cè)平臺(tái)(Swiss Target Prediction)及相關(guān)文獻(xiàn)檢索篩選金銀花活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù),通過(guò)Perl腳本對(duì)藥物有效成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配。在uniprot(https://www.uniprot.org)依次選擇“human”、“reviewed”下載最新所有已經(jīng)驗(yàn)證的人類(lèi)基因靶點(diǎn)信息數(shù)據(jù)包,通過(guò)Perl腳本匹配金銀花活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)Gene Symbol。

1.3.2 膿毒癥疾病靶點(diǎn)研究

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE28750[7]、GSE54514[8]、GSE67652[9]、GSE69528[10]的膿毒癥表達(dá)譜數(shù)據(jù)。GSE28750包括10例膿毒癥和20名健康人群的全血樣本。GSE54514基于基因芯片平臺(tái)GPL6947(35例膿毒癥,18例健康樣本),GSE67652基于芯片平臺(tái)GPL16699(12名膿毒癥患者及12名健康志愿者),數(shù)據(jù)集GSE69528基于平臺(tái)GPL10558(28名健康人和83名膿毒癥患者)。根據(jù)平臺(tái)中的注釋信息,使用探針I(yè)D來(lái)識(shí)別相應(yīng)的基因。使用R軟件的Limma軟件包(版本:3.40.2)研究mRNA的差異表達(dá),校正數(shù)據(jù)批次。在GEO中分析了調(diào)整后的P值以糾正假陽(yáng)性結(jié)果。以“AdjustedP＜0.05且log2(倍數(shù)變化)＞1或log2(倍數(shù)變化)＜-1”為閾值篩選差異表達(dá)基因。同時(shí),以關(guān)鍵詞“sepsis”、“septic”、“septic shock” 在Genecard(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索膿毒癥疾病靶點(diǎn),使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https ://www.uniprot.org/)對(duì)疾病疾病靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)基因識(shí)別轉(zhuǎn)換,與GEO分析所得差異基因進(jìn)行整合,消除重復(fù)項(xiàng),最終得到膿毒癥靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.3 金銀花水提物活性成分與膿毒癥靶點(diǎn)相關(guān)性研究

基于1.3.1、1.3.2所整理的數(shù)據(jù),使用R包根據(jù)金銀花活性成分靶點(diǎn)與金銀花水提物-膿毒癥復(fù)合靶點(diǎn)預(yù)測(cè)出金銀花治療膿毒癥活性成分,通過(guò)Perl腳本和Cytoscape軟件構(gòu)建金銀花活性成分-膿毒癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3.4 金銀花水提物活性成分與膿毒癥靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)及核心基因研究

在上述分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們將金銀花活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與膿毒癥靶點(diǎn)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配,得到金銀花-膿毒癥復(fù)合靶點(diǎn),上傳至STRING(https://string-db.org/)在線平臺(tái)進(jìn)行蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作用(PPI)分析。本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)既往研究及大數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因來(lái)標(biāo)注靶點(diǎn)基因與其他基因之間的功能交互作用,并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖形予以展示。我們可以認(rèn)為處于節(jié)點(diǎn)的基因在生物過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用。并將蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape軟件中,使用CytoNCA插件計(jì)算靶 點(diǎn) 基 因BC、CC、Degree、Eigenvector、LAC、Network,篩選出大于所有參數(shù)中位數(shù)的基因,生成核心基因網(wǎng)絡(luò)[11]。

1.3.5 金銀花治療膿毒癥的具有生物標(biāo)志物特征的核心基因

為了對(duì)1.3.4中核心網(wǎng)絡(luò)的基因賦予臨床診療價(jià)值,本研究使用受試者操作特征曲線(ROC)對(duì)核心網(wǎng)絡(luò)的基因進(jìn)行分析。通過(guò)比較ROC曲線下面積(AUC)評(píng)估所選金銀花靶點(diǎn)對(duì)膿毒癥治療特性,篩選其中AUC＞0.8的基因作為金銀花水提物治療膿毒癥的潛在靶點(diǎn)基因。

1.3.6 金銀花水提物對(duì)RAW264.7膿毒癥細(xì)胞模型潛在靶點(diǎn)基因和炎癥因子mRNA表達(dá)干預(yù)研究

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7使用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育(5% CO2,37℃),選擇細(xì)胞80%密度時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。除對(duì)照組外,模型組和實(shí)驗(yàn)組均使用LPS(0.5 μg/mL)刺激RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行造模,其中實(shí)驗(yàn)組造模前使用濃度為75 μg/mL的金銀花水提取物預(yù)處理2 h。造模24 h后按照說(shuō)明書(shū)流程使用RNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量,并計(jì)算各組分中金銀花水提物治療膿毒癥相關(guān)炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS)和關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的相對(duì)表達(dá)量。β-actin、IL-1β、IL-6、MAPK1和MYC等引物由擎科生物(中國(guó),上海)設(shè)計(jì)、合成(表 1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖片生成均采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用Studentt檢驗(yàn),以P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金銀花水提物的主要成分

UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測(cè)結(jié)果顯示,在正、負(fù)離子流模式下共鑒定出59個(gè)可能的金銀花水提物成分。經(jīng)TCMSP、Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)檢索分析出金銀花水提物活性成分23個(gè),預(yù)測(cè)出對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)386個(gè)。金銀花水提物總離子流圖見(jiàn)圖1,金銀花水提物活性成分見(jiàn)表2。

表2 金銀花水提物成分表Table 2 Constituents of Lonicerae japonicae flos water extract

圖1 金銀花水提物總離子流圖Figure 1 Total ion current chromatogram of Lonicera japonica flos

2.2 金銀花水提物治療膿毒癥的活性成分和靶點(diǎn)

聯(lián)合分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的四個(gè)基因芯片(GSE28750、GSE54514、GSE67652、GSE69528)發(fā)現(xiàn)了1298個(gè)與膿毒癥相關(guān)的差異表達(dá)基因(圖2A)。此外,整合了Genecard、OMIM、TDD、Drugbank 4大數(shù)據(jù)庫(kù)的疾病靶標(biāo)2533個(gè)(圖2B),將疾病靶標(biāo)與GEO分析結(jié)果相結(jié)合并消除重復(fù)值,進(jìn)而確定了3831個(gè)膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)。將金銀花的活性成分靶標(biāo)與膿毒癥的疾病靶標(biāo)進(jìn)行匹配,篩選出244個(gè)金銀花和膿毒癥的復(fù)合靶標(biāo)(圖2C)。使用Cytoscape軟件生成金銀花水提物治療膿毒癥靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)圖(圖3),按照Degree度值對(duì)化合物進(jìn)行排名,木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢(qián)子苷和咖啡酸為排名前五的金銀花水提物治療膿毒癥成分。

圖2 金銀花活性成分靶點(diǎn)與膿毒癥靶點(diǎn)韋恩圖Figure 2 Venn diagram of Lonicerae japonicae flos active ingredient target genes and sepsis target genes

圖3 金銀花活性成分-膿毒癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 3 Lonicerae japonicae flos active ingredient-sepsis target network

2.3 金銀花水提物治療膿毒癥的核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將244個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至STRING,生成蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)圖,置信度得分設(shè)置為0.4,共有244個(gè)節(jié)點(diǎn),4902條邊,平均節(jié)點(diǎn)度值40.2(圖4A)。將上述PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape后使用CytoNCA插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行BC、CC、Degree、Eigenvector、LAC、Network計(jì)算分析,再使用Perl腳本篩選出所有條件都大于中位值的核心基因,循環(huán)計(jì)算2次(第二次循環(huán)Betweenness＞21.0496、Closeness＞0.5212、Degree＞9、Eigenvector＞0.1078、LAC＞4.125、Network＞5.0142),最終預(yù)測(cè)出17個(gè)核心靶點(diǎn)基因(圖4B、4C)(表3):MYC、ESR1、SRC、JUN、RB1、CCND1、MAPK8、TP53、NFKBIA、FOS、MAPK1、AKT1、HSP90AA1、PIK3R1、RELA、TNF、EGFR。

表3 金銀花治療膿毒癥核心基因Table 3 Lonicerae japonicae flos sepsis hub genes

圖4 金銀花-膿毒癥基因靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖和核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Lonicerae japonicae flos sepsis PPI network and hub genes network

2.4 金銀花治療膿毒癥的具有生物標(biāo)志物特征的核心基因

膿毒癥診斷特性的ROC曲線結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)基因MAPK8、TP53、RELA、MAPK1和MYC的ROC曲線下面積(AUC)＞85(P＜0.05)。對(duì)膿毒癥診斷特異性、敏感性均大于80,表現(xiàn)出了對(duì)膿毒癥診斷較好的較好敏感性和特異性,進(jìn)而選取作為金銀花水提物治療膿毒癥的具有生物標(biāo)志物特性的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)一步驗(yàn)證分析。見(jiàn)圖5。

圖5 金銀花治療膿毒癥核心基因ROC曲線Figure 5 Lonicerae japonicae flos sepsis hub genes ROC curve

2.5 金銀花水提物對(duì)膿毒癥相關(guān)靶點(diǎn)和炎癥因子的調(diào)控作用

用RT-qPCR測(cè)量膿毒癥8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因(MAPK8、JUN、RELA、AKT1、MAPK1、TP53、MYC、FOS)及相關(guān)炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-10、iNOS、TNF-α)的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與正常組相比,LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞中膿毒癥相關(guān)關(guān)鍵靶點(diǎn)基因和炎性因子表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。與模型組相比,金銀花藥物干預(yù)組MAPK8、TP53、RELA、MAPK1、MYC和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-10、iNOS、TNF-α表達(dá)顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 金銀花對(duì)膿毒癥關(guān)鍵靶點(diǎn)基因相對(duì)表達(dá)量的調(diào)控作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Lonicerae japonicae flos intervention group. Compared with the control group, *P＜0.05,****P＜0.0001.Figure 6 Effect of Lonicerae japonicae flos on relative expression of sepsis related hub genes

圖7 金銀花對(duì)膿毒癥相關(guān)炎性基因相對(duì)表達(dá)量的調(diào)控作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Lonicerae japonicae flos intervention group. Compared with the control group, ****P＜0.0001.Figure 7 Effect of Lonicerae japonicae flos on relative expression of sepsis related inflammatory genes

3 討論

本研究中,金銀花水提物對(duì)細(xì)胞膿毒癥模型炎癥顯示出顯著的抑制作用。通過(guò)UPLC-QExactiveOrbitrap-MS檢測(cè)得到金銀花水提物主要成分,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)金銀花進(jìn)行成分分析及膿毒癥治療機(jī)制預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)金銀花水提物的五種主要成分木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢(qián)子苷和咖啡酸參與抑制膿毒癥炎癥,進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)表明,MAPK8、TP53、RELA、MAPK1、MYC可能為金銀花作用于膿毒癥的關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)。

金銀花水提物對(duì)膿毒癥作用靶點(diǎn)的調(diào)控作用明顯。導(dǎo)致膿毒癥炎癥反應(yīng)失衡的相關(guān)靶點(diǎn)和通路很多,包括MAPK、NF-κB、IL-17、AMPK及mTOR等通路及靶點(diǎn)。其中,MAPK通路在致炎條件刺激下通過(guò)ERK、JNK、P38等途徑在調(diào)控炎癥因子生成方面發(fā)揮重要作用。本次研究發(fā)現(xiàn)MAPK通路中的MAPK8、MAPK1與下游通路RELA、TP53及MYC在金銀花水提物改善膿毒癥炎癥過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。MAPK8、MAPK1與RELA、TP53及MYC在先前的文獻(xiàn)研究被提及通過(guò)MAPK/NF-κB、MAPK/P53、MAPK/c-MYC通路[12-14]在免疫介導(dǎo)多種炎癥疾病中發(fā)揮作用。其中,TP53為腫瘤抑制基因,敗血癥期間T淋巴細(xì)胞中的P53表達(dá)可能有助于增強(qiáng)T細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致免疫功能障礙[15],TP53通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié) mTOR通路,在真菌膿毒癥期間通過(guò)自噬-凋亡途徑對(duì)促進(jìn)CD4T細(xì)胞細(xì)胞自噬發(fā)揮重要的作用[16-17]。MAPK1和MAPK8是MAPK通路中的主要亞族,當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí),中MAPK1通過(guò)NOD樣通路將外部信號(hào)由細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核,促進(jìn)由NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的各種炎癥因子(如:TNF-α和IL-1β)的釋放,加重細(xì)胞損傷[18]。另有針對(duì)MAPK3/MAPK1信號(hào)通路的靶向藥物在治療如小鼠海馬體炎癥[19]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[20]及急性肺部炎癥[21]等各種炎癥性疾病中具有重要的價(jià)值[21]。最新研究表明,在蓮花清瘟治療小鼠膿毒癥急性肺損傷實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,同樣篩選出TP53、MAPK1、MAPK8為膿毒癥治療關(guān)鍵靶點(diǎn)基因,并可能通過(guò)抑制 P53 介導(dǎo)的內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑減輕 LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷[22]。另一關(guān)鍵靶點(diǎn)基因RELA在機(jī)體免疫過(guò)程中可被IL-1β以及TNF-α等細(xì)胞因子激活,進(jìn)而活化NF-κB發(fā)揮促炎作用[23]。還可通過(guò)MAPK/c-Myc 通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)減輕敗血癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[24]。上述文獻(xiàn)研究表明,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合這5個(gè)靶點(diǎn)基因在膿毒癥炎癥相關(guān)信號(hào)通路中所涉及的基因的表達(dá)情況,金銀花水提物在LPS膿毒癥細(xì)胞模型中抑制了TP53、MAPK8、MAPK1、RELA表達(dá),上調(diào)MYC基因表達(dá)。這表明金銀花水提物中的多種活性成分可能通過(guò)作用于上述靶點(diǎn)及所在通路,調(diào)控過(guò)度炎癥反應(yīng)和免疫抑制來(lái)改善膿毒癥的免疫失調(diào),以及改善隨后導(dǎo)致的多器官功能障礙和并發(fā)癥。

長(zhǎng)期大量的臨床觀察研究表明,膿毒癥患者免疫功能受損所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)失調(diào)是膿毒癥患者病情進(jìn)展的重要原因[25-26],而金銀花所含的主要成分在預(yù)防和改善膿毒癥方面的作用已有初步探索。本研究使用RT-qPCR對(duì)膿毒癥細(xì)胞模型的炎癥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LPS造模后,IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等炎性因子及其誘導(dǎo)基因iNOS均高表達(dá)。與針對(duì)單一靶點(diǎn)的西藥不同,中藥可以通過(guò)多成分作用于多靶點(diǎn)來(lái)進(jìn)行整體施治。當(dāng)代中醫(yī)認(rèn)為膿毒癥發(fā)生發(fā)展主因“毒”、“瘀”、“虛”。邪氣侵襲,正邪交爭(zhēng),生痰生瘀,繼而脈絡(luò)瘀滯,致使臟腑不得氣血濡養(yǎng),機(jī)能紊亂,甚者內(nèi)閉外脫。同時(shí)邪氣流連亦可令正氣漸傷,日久邪實(shí)正虛,正氣將絕[2,27]。目前中醫(yī)治療膿毒癥首選清熱解毒療法,其中單味中藥金銀花及提取物在目前研究中表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)功效[28]。金銀花是我國(guó)傳統(tǒng)清熱解毒中藥之一,藥理學(xué)分析表明金銀花的主要成分為黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油及其他類(lèi)物質(zhì),具有顯著的清熱解毒、抗炎、抗菌及抗氧化等功效。近年來(lái)的研究顯示出金銀花水提取物的某些成分在預(yù)防和改善膿毒癥方面有較好的效果,特別是其中的黃酮及有機(jī)酸類(lèi)化合物,如綠原酸[29]、金絲桃苷[30]、槲皮素[31]、異槲皮苷[32]及木犀草苷[6]等成分在既往研究中均被證明可預(yù)防膿毒癥及其并發(fā)癥,并且能減少膿毒癥過(guò)程中炎癥因子產(chǎn)生。既有研究表明,木犀草素可以改善膿毒癥小鼠的急性肺損傷[33];在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞和小鼠模型中,抑制高遷移率族蛋白B1,降低炎癥因子釋放和膿毒癥小鼠死亡率[34]。山奈酚可減輕小鼠膿毒癥盲腸結(jié)扎穿刺模型的急性肺損傷[35],和白楊素協(xié)同作用時(shí)能提高敗血癥小鼠的存活率[36]。槲皮素能通過(guò)減輕炎癥和氧化應(yīng)激、降低TOL樣受體的基因表達(dá),調(diào)節(jié)免疫狀態(tài),改善膿毒癥器官損傷[37]。馬錢(qián)子苷通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和抑制 NLRP3 炎癥小體激活減輕膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷[38]?？Х人嵫苌锞G原酸及咖啡酸苯乙酯可降低膿毒癥大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激[39]。在本研究中,同樣含有木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢(qián)子苷和咖啡酸五種主要成分的金銀花水提物在LPS膿毒癥模型中抑制了炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS基因mRNA的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了上述早期發(fā)現(xiàn)。

近幾年研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥患者早期同時(shí)存在炎癥反應(yīng)過(guò)度激活和免疫抑制狀態(tài),二者相互作用,共同影響膿毒癥的發(fā)生發(fā)展[40]。這也解釋了為什么單純地抗感染治療并不能明顯改善膿毒癥患者預(yù)后?，F(xiàn)在,我們可以利用超高效液相質(zhì)譜技術(shù)分析中藥有效成分和生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)分析相關(guān)靶點(diǎn),篩選出金銀花改善膿毒癥的基因并探索其機(jī)制,為金銀花在膿毒癥的臨床治療找到關(guān)鍵靶點(diǎn),為后期藥物研發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上,我們對(duì)金銀花治療膿毒癥的活性成分及藥物-膿毒癥核心靶點(diǎn)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)金銀花治療膿毒癥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),并找出金銀花治療膿毒癥可能的活性成分木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢(qián)子苷和咖啡酸,以及金銀花防治膿毒癥的機(jī)制與調(diào)控MAPK及下游通路靶點(diǎn)TP53、MAPK8、MAPK1、RELA、MYC和調(diào)控的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS有關(guān)。此研究為金銀花活性成分如何發(fā)揮治療膿毒癥的深入研究提供參考,也為相關(guān)疾病治療提供新的思路。