劉 艷顧 鵬葉 行梁春錦關(guān)雅今張映輝鄒慶劍*顧為望*

(1.五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院,廣東 江門 529020;2.江門市大健康國際創(chuàng)新研究院,廣東 江門 592040;3.華南生物醫(yī)藥大動(dòng)物模型研究院,廣東省醫(yī)學(xué)大動(dòng)物模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 江門 529728;4.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所,廣州 510515)

人延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumaroylacetoacetate hydrolase,FAH)位于染色體15q25.1,主要在肝和腎中表達(dá),是酪氨酸代謝通路最后一步的酶[1]。FAH缺失會(huì)導(dǎo)致其上游中間代謝產(chǎn)物在肝細(xì)胞中積累,并通過旁代謝通路轉(zhuǎn)化為琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate,SAA)和琥珀酰丙酮(succinylacetone,SA)[2]。這兩種代謝產(chǎn)物與其它蛋白的巰基結(jié)合,影響其功能,最終造成肝、腎損傷,形成I型遺傳性酪氨酸血癥(HT1)[3],大多數(shù)HT1患者在嬰兒早期就會(huì)死于急性嚴(yán)重的肝腎功能衰竭[4]。HT1目前的治療方法主要通過飲食、藥物或肝移植治療控制疾病,降低血酪氨酸及其代謝產(chǎn)物水平,減輕酪氨酸及其代謝產(chǎn)物對機(jī)體的損傷,目前沒有簡便且有效的治愈方法。

肝中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-Z1(glutathione Stransferase zeta 1,GSTZ1)是酪氨酸代謝通路的倒數(shù)第二個(gè)酶,屬于谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)超家族新成員。催化馬來酰乙酰乙酸酯(maleylacetoacetate,MAA)異構(gòu)化為延胡索酰乙酰乙酸(fumarylacetoacetate,FAA)[5]。作為GST家族的一員,GSTZ1還能催化二氯乙酸鹽(dichloroacetate,DCA)氧化生成乙醛酸,并可能參與外源α-鹵酸代謝[6-7]。人GSTZ1基 因 定 位 于 人 類 染 色 體14q24.3,長度為10.9 kb[8],主要在肝中表達(dá),編碼216個(gè)氨基酸組成,分子量在24×103左右[9]。研究發(fā)現(xiàn)GSTZ1在肝細(xì)胞癌(HCC)中顯著下調(diào)[10],提示GSTZ1的表達(dá)降低可能導(dǎo)致了細(xì)胞的活性增強(qiáng),但具體機(jī)制未知。

HT1主要病因是FAH的功能缺失,酪氨酸代謝通路中其它酶的作用需要進(jìn)一步了解。通過基因編輯分析各個(gè)基因?qū)υ摷膊〉挠绊?可以更好地了解該疾病的具體發(fā)病機(jī)制。然而,受到倫理道德的限制,很多研究無法直接在人體中進(jìn)行,必須首先通過細(xì)胞以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對疾病做相應(yīng)的研究論證。本研究擬通過建立FAH/GSTZ1雙突變肝細(xì)胞模型,研究GSTZ1的敲除對FAH缺失所導(dǎo)致的肝損傷是否具有影響,進(jìn)一步研究兩個(gè)基因在肝損傷中的作用,以及探索新的HT1肝損傷治療方案。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞系

人正常肝細(xì)胞系LO2來自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室,人胚腎細(xì)胞HEK293T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 載體質(zhì)粒

LentiCRISPR V2和PX458載 體 均 購 自Addgene。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco;C11995500BT)、胎牛血 清(Gibco;10270106)、Opti-MEM?(Gibco;1119701)、0.25%胰酶(Gibco;25200056);無血清細(xì)胞凍存液(新賽美生物科技有限公司;C40100);轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000(Invitrogen;2004957);嘌呤霉素?zé)o菌溶液(Meilunbio;MA0318);全蛋白提取試劑盒(凱基生物;KGP250);蛋白BCA定量試劑盒(Biosharp;BL521A)、ECL化 學(xué) 發(fā) 光 試 劑 盒(Biosharp;BL520A);PVDF膜(Millipore;TPVH00011);GSTZ1單克隆抗體(Proteintech;14889-1-AP);FAH抗體(K004637P)、GAPDH抗體(K200057 M)、二抗羊抗兔(SE134)和二抗羊抗小鼠(SE131)、CCK8試劑(CA1210)、1%結(jié)晶紫染液(G1062)均購自Solarbio;T4 PNK磷酸酶(M0201 S)、BsmBI(R0580 L)和BbsI(00397116)限制性內(nèi)切酶均購自NEB;T4DNA連接酶(TaKaRa;M0202 S);EdU檢測劑盒(BBI;E607204-0100);基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN;DP304);無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(TIANGEN;DP117-TA)。

細(xì)胞培養(yǎng)皿、Transwell小室、離心管、細(xì)胞凍存管(Corning);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜和NanoDrop 2000(Thermo Scientific);PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠自動(dòng)成像儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad);超純水儀(ELGA);低速離心機(jī)(Eppendorf);旋渦振蕩器(QILINBEIER);倒置熒光顯微鏡(Nikon)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因敲除載體構(gòu)建

(1)GSTZ1位點(diǎn)基因編輯質(zhì)粒的構(gòu)建

通過GeneBank網(wǎng)站(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找人的GSTZ1基因組序列。在人GSTZ1基因第6號外顯子(E6)上找到N20NGG的靶向序列,合成相應(yīng)的兩條互補(bǔ)的單鏈引物(表1),退火形成雙鏈DNA片段。LentiCRISPR V2載體用BsmBI酶切,回收后與雙鏈DNA片段在T4 DNA連接酶作用下,16℃進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后涂板,利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,并送測序分析。測序正確的質(zhì)粒稱為LentiCRISPR-V2-sgRNAGSTZ1,將用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

(2)FAH位點(diǎn)基因編輯質(zhì)粒的構(gòu)建

在GeneBank網(wǎng)站查找人的FAH基因組序列。在人FAH基因第7、8號外顯子(E7、E8)上找到兩個(gè)N20NGG的靶向序列,合成相應(yīng)的兩條互補(bǔ)的單鏈引物(表1),退火形成雙鏈DNA片段。PX458載體用BbsI酶切,回收后與雙鏈DNA片段在T4 DNA連接酶作用下,16℃進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后涂板,利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA,并送測序分析,將序列正確的質(zhì)粒(PX458-sgRNAFAH)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 基因編輯引導(dǎo)RNA引物Table 1 Design of primers for guide RNA construction

1.3.2GSTZ1基因敲除細(xì)胞的構(gòu)建

(1)慢病毒包裝

HEK293 T細(xì)胞培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。轉(zhuǎn)染前1 d鋪60%匯合度的HEK293 T細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中,24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染試劑為脂質(zhì)體lipofectamine 2000,將LentiCRISPR-V2-sgRNAGSTZ1與包裝質(zhì)粒pMD2.G、pSPAX2按照質(zhì)量比4∶1∶3的比例混合后轉(zhuǎn)染HEK293 T細(xì)胞,8 h后換成新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng),于48、72 h后分別收集培養(yǎng)基上清液,3000 r/min離心5 min去除細(xì)胞碎片,0.45 μm濾膜過濾,并將病毒上清液分裝為每管1 mL,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)慢病毒感染LO2細(xì)胞

LO2細(xì)胞培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。慢病毒感染前1 d鋪40%匯合度的LO2細(xì)胞于6孔板,12 h后加入1 mL的慢病毒上清液感染LO2細(xì)胞。

(3)摸索嘌呤霉素殺傷LO2細(xì)胞的最適工作濃度

將40%匯合度的LO2細(xì)胞鋪于6孔板中,12 h后加入不同濃度梯度的嘌呤霉素(0、0.1、1、4.5 μg/mL)至細(xì)胞培養(yǎng)基中。48 h后觀察細(xì)胞存活情況,選取細(xì)胞全部死亡的最低濃度為后續(xù)篩選的工作濃度。

1.3.3 篩選GSTZ1敲除細(xì)胞株

慢病毒感染LO2細(xì)胞2 d后,加含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選。待對照組LO2細(xì)胞全部被殺死后,將感染慢病毒的LO2細(xì)胞用胰酶消化,利用有限稀釋法將細(xì)胞稀釋成每毫升100個(gè)細(xì)胞,取10 μL加入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。1周后待單個(gè)細(xì)胞長成細(xì)胞團(tuán)后,消化傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。取單克隆細(xì)胞株部分細(xì)胞提取基因組DNA,利用鑒定引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序分析。將具有目標(biāo)基因突變的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和凍存保存。

1.3.4FAH基因敲除細(xì)胞株的篩選

將構(gòu)建好的PX458-sgRNAFAH共轉(zhuǎn)染進(jìn)野生型(wild type, WT)LO2細(xì)胞和GSTZ1敲除的LO2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine 2000,轉(zhuǎn)染過程按照說明書操作。轉(zhuǎn)染12 h后,換成10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后,用胰酶消化,利用有限稀釋法將細(xì)胞稀釋成每毫升100個(gè)細(xì)胞,取10 μL加入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。一周后待單個(gè)細(xì)胞長成細(xì)胞團(tuán)后,消化傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。取單克隆細(xì)胞株部分細(xì)胞提取基因組DNA,利用鑒定引物(表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序分析。將具有目標(biāo)基因突變的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和凍存保存。

表2 基因編輯鑒定引物Table 2 Primers for gene editing identification

1.3.5 敲除細(xì)胞株功能學(xué)實(shí)驗(yàn)

(1)Western blot檢測GSTZ1、FAH蛋白表達(dá)情況

收集細(xì)胞后,利用全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,取10 μL進(jìn)行凝膠電泳。SDS-PAGE分離膠和濃縮膠分別按照濃度為10%和5%配制,電壓為恒壓80 V,30 min;120 V,40 min。再電轉(zhuǎn)入PVDF膜,電流200 mA,120 min。5% BSA封閉2 h,GSTZ1、FAH的抗體以及GAPDH內(nèi)參抗體作為一抗分別4℃孵育過夜。用TBST室溫?fù)u床洗膜4次,加入二抗后室溫孵育1 h。最后加入ECL顯色后,觀察拍照。

(2)CCK8檢測細(xì)胞增殖

將GSTZ1、FAH敲除細(xì)胞及親本對照組細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù),以每孔1×104密度鋪至96孔板中,每個(gè)樣品6個(gè)重復(fù)。同時(shí)以全培為空白對照,分別在0、6、12、24和48 h加入10 μL CCK8溶液,37℃避光孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度,用細(xì)胞的吸光度扣除空白對照的吸光度,得到相對吸光度值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

(3)克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

將GSTZ1、FAH敲除細(xì)胞及親本對照組細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù),以每孔1×103密度鋪至6孔板中,正常培養(yǎng)14 d。待細(xì)胞長至肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí),去除培養(yǎng)基,采用PBS輕柔清洗細(xì)胞兩次后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min。然后棄去多聚甲醛,用清水清洗細(xì)胞表面,晾干后用1%結(jié)晶紫染色10 min。最后用清水洗凈染液,于體視顯微鏡下計(jì)數(shù)。

(4)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移

將GSTZ1、FAH敲除細(xì)胞及親本對照組細(xì)胞胰酶消化后計(jì)數(shù),以每孔5×104密度鋪置6孔板中。待細(xì)胞長滿后,使用200 μL槍頭劃痕細(xì)胞,洗去細(xì)胞碎片,換成2%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。間隔72 h后再次拍照,計(jì)算細(xì)胞相對遷移距離比(0 h距離-72 h距離)/0 h距離。

(5)EdU分析

將GSTZ1、FAH敲除細(xì)胞及親本對照組細(xì)胞使用EdU細(xì)胞增殖試劑盒評估其增殖能力。將60%匯合度細(xì)胞鋪至24孔板中,12 h后換成1×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h,采用PBS輕柔清洗細(xì)胞兩次后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,棄去多聚甲醛,利用PBS清洗細(xì)胞兩次。按照說明書將1×反應(yīng)緩沖液、催化劑溶液、TAMRA紅色熒光溶液和緩沖添加劑按照一定比例配制成檢測混合液,將其加入細(xì)胞中并室溫避光孵育30 min,利用PBS清洗細(xì)胞。檢測前,用PBS將Hoechst稀釋成1×染色液,室溫避光孵育30 min,用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphpad prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LO2細(xì)胞篩選條件測試

LO2細(xì)胞為正常人源肝細(xì)胞,目前還沒有文獻(xiàn)對其進(jìn)行嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)。我們在正常培養(yǎng)的LO2細(xì)胞培養(yǎng)基中設(shè)置了4組不同濃度梯度的嘌呤霉素,發(fā)現(xiàn)最高濃度4.5 μg/mL嘌呤霉素可在48 h殺死全部野生型LO2細(xì)胞(圖1)。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,篩選基因編輯細(xì)胞系均采用終濃度4.5 μg/mL的嘌呤霉素。

圖1 LO2細(xì)胞對puromycin藥物濃度的耐受測試Figure 1 Sensitivity of LO2 cells to puromycin

2.2 細(xì)胞敲除模型的構(gòu)建

2.2.1GSTZ1基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建

LO2細(xì)胞的GSTZ1基因敲除位點(diǎn)設(shè)計(jì)在基因的第6號外顯子(圖2A)。LentiCRISPR V2-sgRNAGSTZ1構(gòu)建成功,并包裝獲得慢病毒顆粒,進(jìn)而感染LO2細(xì)胞,獲得10株細(xì)胞克隆?；蚪MPCR和測序顯示除了野生型序列外,共有6種突變形式,從缺失1～35 bp不等(圖2B)。其中克隆#6在gRNA靶位點(diǎn)刪除了5 bp,導(dǎo)致移碼突變,提前形成終止密碼TAA(圖2C),將會(huì)導(dǎo)致表達(dá)出截短的無功能的GSTZ1蛋白。將這個(gè)細(xì)胞克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

2.2.2FAH基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建

進(jìn)一步在FAH基因的第7和第8外顯子分別設(shè)計(jì)兩個(gè)基因編輯靶位點(diǎn)。將兩個(gè)基因編輯質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到野生型LO2細(xì)胞和GSTZ1突變的LO2細(xì)胞中。通過有限稀釋法篩選,分別獲得了6株細(xì)胞克隆,PCR和測序結(jié)果顯示主要有7種突變形式,包括大片段刪除(如刪除159 bp和163 bp),以及單位點(diǎn)或雙位點(diǎn)基因編輯(圖2D)。野生型和GSTZ1突變的LO2細(xì)胞通過編輯都分別在FAH基因位點(diǎn)獲得了159 bp大片段刪除的細(xì)胞克隆(圖2E)。將這兩株細(xì)胞分別擴(kuò)大培養(yǎng),進(jìn)行進(jìn)一步鑒定實(shí)驗(yàn)。

圖2 人GSTZ1和FAH雙基因敲除LO2細(xì)胞株的建立Note. A, Schematic diagram of the design at human GSTZ1 gene locus. B, Genotype analysis of GSTZ1 knockout cell clones. C, Sequencing analysis at gene targeting sites in wild-type and gene-target cells. D, Schematic diagram of gene targeting site design at human FAH gene locus. E, Genotype analysis of FAH knockout cell clones.Figure 2 Establishment of LO2 cell line with human GSTZ1 and FAH dual-gene knockout

2.3 基因編輯LO2細(xì)胞株GSTZ1與FAH蛋白表達(dá)

首先對GSTZ1基因敲除細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)與野生型對照組比較,GSTZ1基因敲除后,相應(yīng)的蛋白無法檢出(圖3A)。隨后檢測野生型、單個(gè)基因敲除和雙基因敲除細(xì)胞的FAH蛋白,發(fā)現(xiàn)FAH基因敲除后,細(xì)胞內(nèi)源FAH蛋白不再表達(dá)(圖3B)。結(jié)果說明通過基因編輯手段可以將LO2細(xì)胞中的GSTZ1和FAH基因進(jìn)行單獨(dú)和雙敲除,實(shí)現(xiàn)相應(yīng)蛋白的徹底失活。

圖3 蛋白水平檢測GSTZ1和FAH的表達(dá)Note. A, GSTZ1 protein detected by Western blot. B, FAH protein detected by Western blot.Figure 3 GSTZ1 and FAH protein test by Western blot assay

2.4 GSTZ1、FAH敲除對LO2細(xì)胞增殖能力的影響

CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示GSTZ1、FAH基因敲除會(huì)顯著的增加肝細(xì)胞的增殖速率(圖4A)。進(jìn)一步,我們利用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測,同樣發(fā)現(xiàn)敲除GSTZ1、FAH基因后,肝細(xì)胞克隆形成能力也明顯增加(圖4B～4C)。另外,我們還通過EdU染色實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)GSTZ1、FAH基因敲除均顯著增加LO2細(xì)胞的增殖能力(圖4D～4E)。

圖4 GSTZ1和FAH基因敲除對LO2細(xì)胞增殖能力的影響Note. A, Proliferation rates were evaluated via CCK8 trial. B, Colony formation was determined by crystal violet staining. C, Ability of clone formation was investigated by clone formation assay. D, EdU assay for different cell lines. E, percentage of EdU positive cells.Compared with WT, **P＜0.01,***P＜0.001, ****P＜0.0001.Figure 4 Effect of GSTZ1 and FAH gene knockout on the proliferation of LO2 cells

3個(gè)獨(dú)立的測試方式均顯示GSTZ1基因的敲除可大幅提高肝細(xì)胞LO2的增殖活性。FAH基因的敲除也能顯著提高LO2細(xì)胞的活力,但提高幅度大大低于GSTZ1敲除。并且在FAH敲除細(xì)胞的基礎(chǔ)上,敲除GSTZ1可進(jìn)一步提高LO2細(xì)胞的增殖活力。

2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

為驗(yàn)證基因敲除是否影響LO2細(xì)胞的遷移能力,我們利用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察到72 h的GSTZ1敲除細(xì)胞株的相對遷移比為(0.4±0.012),是野生型LO2細(xì)胞的10倍(圖5)。FAH敲除細(xì)胞株的相對遷移比為(0.2±0.014),顯著高于野生型細(xì)胞株。GSTZ1和FAH雙敲除細(xì)胞株的相對遷移比為(0.25±0.021),并且GSTZ1和FAH雙敲除可進(jìn)一步提高細(xì)胞遷移能力。

圖5 GSTZ1和FAH基因敲除對LO2細(xì)胞遷移能力的影響Note. A, Cell migration was observed under a microscope. B, Quantitative determination of cell migration rate. Compared with WT, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 Effect of GSTZ1 and FAH gene knockout on the migration ability of LO2 cells

3 討論

本研究成功構(gòu)建了GSTZ1和FAH單個(gè)基因和雙基因敲除肝細(xì)胞模型,并比較了不同基因編輯細(xì)胞在細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力等方面的差異。FAH和GSTZ1都是肝中酪氨酸代謝通路的關(guān)鍵酶[11]。FAH的缺乏會(huì)導(dǎo)致遺傳性Ⅰ型酪氨酸血癥,并且會(huì)增加肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)[12]。迄今為止,關(guān)于酪氨酸分解代謝的倒數(shù)第二個(gè)酶GSTZ1的研究較少。有研究報(bào)道GSTZ1序列變異引起輕度高琥珀酰丙酮血癥,但沒有肝功能障礙的證據(jù)[13]。GSTZ1缺乏導(dǎo)致GSH耗竭,隨后氧化應(yīng)激升高和持續(xù)的Nrf2激活,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。但目前為止,GSTZ1在人正常肝細(xì)胞中缺失對酪氨酸代謝通路的影響仍然沒有確切研究。我們首次在人正常肝細(xì)胞中進(jìn)行GSTZ1基因突變研究,發(fā)現(xiàn)GSTZ1蛋白功能的缺失對肝細(xì)胞活性具有提升作用,并且對FAH基因突變的肝細(xì)胞的活性也有改善作用。

通過對酪氨酸代謝通路的另一個(gè)關(guān)鍵酶——羥苯丙酮酸二加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)的研究,發(fā)現(xiàn)HPD基因敲除能夠成功阻止因FAH基因缺失所導(dǎo)致的急性致死性肝損傷[14-15]。HPD基因阻斷治療可以有效促進(jìn)酪氨酸代謝的重編程,并恢復(fù)該條代謝途徑中TAT、HGD和GSTZ1的表達(dá),進(jìn)而減少肝的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)。那么同樣作為酪氨酸代謝通路上游的酶GSTZ1是否能達(dá)到HPD對酪氨酸代謝的重編程的效果?研究首次在人正常肝細(xì)胞LO2中敲除了GSTZ1和FAH基因,在FAH突變的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步突變了GSTZ1,分別構(gòu)建了FAH突變、GSTZ1突變和FAH/GSTZ1雙突變肝細(xì)胞模型,Western blot證實(shí)基因突變導(dǎo)致相應(yīng)蛋白缺失。進(jìn)一步通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),首次發(fā)現(xiàn)GSTZ1基因的敲除可增加FAH基因突變細(xì)胞的活性,并且研究發(fā)現(xiàn)FAH和GSTZ1雙突變肝細(xì)胞比FAH突變肝細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性和遷移能力。由于FAH的突變,HT1患者肝細(xì)胞內(nèi)積累大量有毒物質(zhì)FAA,引起肝細(xì)胞損傷。此外,FAA還具有誘變作用,可導(dǎo)致HT1中所見的肝癌[16-17]。GSTZ1是低毒物質(zhì)MAA轉(zhuǎn)變?yōu)镕AA的關(guān)鍵酶,由于GSTZ1敲除會(huì)激活其依賴的谷胱甘肽非酶通路,積累的MAA可以繼續(xù)轉(zhuǎn)化為FAA,相比于GSTZ1正常通路減少了有毒產(chǎn)物FAA的積累,因此對肝細(xì)胞活性和功能影響較小[18]。本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)FAH的敲除并不會(huì)造成LO2肝細(xì)胞的死亡,相反,細(xì)胞活性有一定程度的增強(qiáng)。我們推測FAH突變導(dǎo)致積累的毒素物質(zhì)FAA和SA被釋放到了培養(yǎng)基中,稀釋了FAA對細(xì)胞毒性的作用;另一方面,FAH的缺失也會(huì)影響細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。除此之外,本研究還發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞系LO2中敲除GSTZ1后細(xì)胞的增殖和遷移能力進(jìn)一步增加,可能是由于毒性中間產(chǎn)物減少造成。另有其它研究證實(shí)GSTZ1基因是一個(gè)重要的抑癌因子,突變后也會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。

總之,我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)GSTZ1基因可能成為HT1治療的潛在靶點(diǎn)。未來的研究可以進(jìn)一步在HT1動(dòng)物模型上開發(fā)針對GSTZ1的小分子抑制劑或基因編輯治療,阻斷FAA的形成,探索HT1疾病的治療新方案。