張立魁楊靈波王學(xué)寧

(山西白求恩醫(yī)院,太原 030032)

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection,AD)是指由于各種原因引起血管內(nèi)皮的損傷,血液經(jīng)損傷內(nèi)膜進(jìn)入中膜,導(dǎo)致主動(dòng)脈壁層的分離并隨后形成有或沒有連通的真腔和假腔的一類疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)急性主動(dòng)脈夾層的發(fā)生率估計(jì)為2.6～3.5/100000,起病急驟,死亡率高,21%的患者在入院前死亡,68.2%在入院48 h內(nèi)死亡,1周內(nèi)病死率高達(dá)90%[2-3]。雖然我國(guó)目前尚未有AD的流行病學(xué)數(shù)據(jù),從既往研究報(bào)告推斷,AD發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。除了由遺傳突變引起的家族性疾病(馬凡氏綜合癥和Loeys-Dietz綜合癥)外[4],AD發(fā)作之前的情況,或者AD發(fā)作之后的急性或慢性期,分子發(fā)病機(jī)理在很大程度上是未知的。關(guān)于AD相關(guān)的診斷和治療干預(yù)方法的病理生理,正在研究中。

一項(xiàng)基于人類AD組織中3000多個(gè)基因cDNA微陣列數(shù)據(jù)顯示,炎癥反應(yīng),細(xì)胞外基質(zhì)代謝,增殖反應(yīng)和蛋白質(zhì)合成的基因在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)生了變化[5]。另外更全面的生物信息學(xué)分析顯示,AD疾病發(fā)生的信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中,Janus kinase-2(JAK2)處在核心位置[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)揭示了巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞可通過白介素6(interleukin-6,IL-6)和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞趨化因子MCP-1等促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)參與AD的發(fā)病機(jī)制[7]。在AD的不同階段之間,巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)活性和位置是不同的。總的來說,巨噬細(xì)胞首先在主動(dòng)脈外膜中積聚并浸潤(rùn)介質(zhì),在亞急性和早期組織階段,巨噬細(xì)胞主要集中在外周脂肪組織中;在急性期巨噬細(xì)胞(CD68+)集中在血腫中,內(nèi)膜和中層鄰近血腫[8]。除此之外,巨噬細(xì)胞除驅(qū)動(dòng)主動(dòng)脈的病理性破裂之外,也參與AD中發(fā)生的組織修復(fù)過程[9]。因此,鑒定對(duì)AD的發(fā)病機(jī)理和修復(fù)有貢獻(xiàn)的特定巨噬細(xì)胞群對(duì)于研究AD發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

該研究通過分析AD相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),探索AD相關(guān)的細(xì)胞群體變化,同時(shí)分析AD相關(guān)差異基因所執(zhí)行的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。在此基礎(chǔ)上,我們利用Ang II和BAPN構(gòu)建的AD小鼠模型,探索巨噬細(xì)胞分型在AD發(fā)生中的具體變化,為研究巨噬細(xì)胞在AD扮演的角色提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(晉)2019-0004],動(dòng)物飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(晉)2019-0007],體重(19.5±0.42)g,鼠齡6～8周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用、操作許可由山西白求恩醫(yī)院(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(SBQDL-2021-002),動(dòng)物護(hù)理和本研究的所有實(shí)驗(yàn)都遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心和山西白求恩醫(yī)院(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的指導(dǎo)方針,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則,盡量動(dòng)物替代、減少動(dòng)物用量、降低動(dòng)物痛苦傷害,給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素(G1120,索萊寶 中國(guó));伊紅(G1120,索萊寶 中國(guó));OCT冰凍切片包埋劑膠(4583,索萊寶中國(guó));0.1% Triton X-100(T8200,索萊寶 中國(guó));5%山羊血清(SL038,索萊寶 中國(guó));CD68(1∶250,abcam,ab216526),iNOS(1∶250,abcam,ab178945),CD206(1∶250,abcam,ab64693);羊抗小鼠FITC(1∶500,SF132,索萊寶 中國(guó));羊抗兔RBITC(1∶500,SR134,索萊寶 中國(guó));DAPI(C0065,索萊寶 中國(guó));RIPA裂解液(P0013B,碧云天 中國(guó));BCA試劑盒(23225,賽默飛 美國(guó));TGX Stain-FreeTM預(yù)制膠(5678081,伯樂 美國(guó));CD68(1∶1000,ab216526 abcam England);iNOS(1∶1000,ab178945 abcam England);CD206(1∶1000,ab64693 abcam England);羊抗小鼠(1∶10000,SE132,索萊寶 中國(guó));羊抗兔HRP(1∶10000,SE134,索萊寶 中國(guó));增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(PE0010,索萊寶 中國(guó));IL-6(E-EL-M2453c,伊萊瑞特 中國(guó));IL-10(EEL-M0046c,伊萊瑞特 中國(guó))。顯微成像系統(tǒng)(Scope A1,蔡司 德國(guó));凝膠成像儀成像(ChemiDoc XRS+,Bio-Rad 美國(guó));酶標(biāo)儀(Elx808,伯騰 美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AD相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

本研究從NCBI公共基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Gene Expression Omnibus(GEO)下載AD相關(guān)的mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集,檢索詞為:aortic Dissection,expression profiling by array, homo sapiens,截止時(shí)間為2021.04.15。

1.3.2 差異基因分析及相關(guān)生物學(xué)功能和信號(hào)通路注釋

研究使用R 4.0.2 edgeR包,利用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法用于對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化處理,當(dāng)log|FC|≥1和P＜0.05,認(rèn)為基因?yàn)锳D相關(guān)差異基因。之后,采用R 4.0.2 clusterProfiler包,對(duì)差異基因進(jìn)行生物學(xué)功能注釋(gene ontology,GO)和信號(hào)通路注釋(kyoto encyclopedia of genes,KEGG)。

1.3.3 AD血管內(nèi)環(huán)境細(xì)胞分析

CIBERSORT是一種分析工具,具有547個(gè)標(biāo)記基因的基因表達(dá)矩陣,基于反卷積算法,可以用于量化mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的免疫細(xì)胞組成部分[10]。研究從CIBERSORT網(wǎng)站(http://cibersort.stanford.edu/)下載帶注釋的基因矩陣LM22,可定義22種免疫細(xì)胞亞型,包括7種T細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、靜息NK細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0、M1、M2巨噬細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、靜息的肥大細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。使用R.4.0.2 CIBERSORT包分析來自TCGA和GEO隊(duì)列的AD血管內(nèi)環(huán)境的免疫細(xì)胞組分。

1.3.4 AD動(dòng)物模型造模

清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只。將小鼠隨機(jī)分為BAPN腹腔注射組,Ang II腹腔注射組,BAPN和Ang II聯(lián)合注射組,生理鹽水腹腔注射組,每組10只。BAPN注射劑量:100 mg/(kg·d),Ang II注射劑量:4 mg/(kg·d),BAPN和Ang II聯(lián)合劑量為100 mg/(kg·d)和4 mg/(kg·d)。每日按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同組別小鼠給予藥物處理,給藥2周,每8 h觀察1次小鼠,每2 d記錄1次體重,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,使用戊巴比妥鈉靜脈麻醉小鼠后,取靜脈血,離心后,凍存至-80℃冰箱。隨后頸椎脫臼法處死小鼠,體視顯微鏡下分離主動(dòng)脈,從主動(dòng)脈根部剝離動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分支處,小心去除動(dòng)脈外膜的疏松結(jié)締組織,觀察夾層形成情況,隨后一部分用4%甲醛固定,另一部分凍存至-80℃冰箱。

1.3.5 蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)

4%多聚甲醛灌注固定主動(dòng)脈組織,石蠟包埋。切成5 μm厚度的切片。切片烤片后,脫蠟、水化,蘇木素染色5 min,鹽酸酒精分化數(shù)秒,氨水浸泡15 min,伊紅染色2 min,蒸餾水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。

1.3.6 免疫熒光染色(immunofluorescence,IF)

用OCT冰凍切片包埋劑膠固定出主動(dòng)脈,由病理科專業(yè)人員用冰凍切片機(jī)切6 μm厚度冰凍切片。冰凍切片組織丙酮固定10 min,PBS洗3次,0.1% Triton X-100通透10 min,5%山羊血清封閉30 min,去除封閉血清,CD68(1∶250),iNOS(1∶250),CD206(1∶250)一抗4℃孵育過夜,羊抗小鼠FITC(1∶500)和羊抗兔RBITC(1∶500)二抗室溫孵育30 min,DAPI室溫染核5 min,用抗熒光淬滅封片劑封片,于顯微成像系統(tǒng)觀察。

1.3.7 免疫蛋白印跡(Western blot)

使用RIPA裂解液提取主動(dòng)脈蛋白,BCA試劑盒測(cè)定樣品的蛋白濃度。TGX Stain-FreeTM預(yù)制膠恒壓250 V,電泳25 min,待染料前沿移行到距離凝膠底部2～3 mm時(shí)停止,利用濕轉(zhuǎn)法,恒流200 mA將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(時(shí)間可根據(jù)目的蛋白分子量適當(dāng)調(diào)整)。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,CD68(1∶1000),iNOS(1∶1000),CD206(1∶1000)4℃搖床過夜,PBST洗膜3次,每次10 min,之后使用羊抗小鼠(1∶10000)和羊抗兔HRP(1∶10000)二抗室溫孵育30 min,PBST洗膜3次,每次10 min。利用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)。使用凝膠成像儀成像并進(jìn)行半定量分析。

1.3.8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)

主動(dòng)脈組織用冷PBS(0.01 mol/L;pH = 7.2～7.4)洗滌去除血液。將干凈的組織切成小塊,并在冰上的PBS中勻漿。收集組織勻漿并在4℃下以3000 r/min離心5 min。根據(jù)制造商的說明,使用ELISA試劑盒對(duì)上清液進(jìn)行了IL-6和IL-10的檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,定量計(jì)算主動(dòng)脈組織中IL-6和IL-10的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R4.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法用于對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化處理,當(dāng)log|FC|≥1和P＜0.05,認(rèn)為基因?yàn)锳D相關(guān)差異基因。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。方差齊時(shí),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);方差不齊時(shí),兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或構(gòu)成比(%)表示,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD相關(guān)差異基因及相關(guān)GO分析和KEGG分析

研究根據(jù)材料和方法中描述的檢索詞,納入AD相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集為GSE147026,4例正常主動(dòng)脈組織,4例AD組織。以log|FC|≥1和P＜0.05為條件,篩選出上調(diào)基因(AD組高于正常組)515個(gè),下調(diào)基因(AD組低于正常組)415個(gè)(圖1A)。GO分析和KEGG分析,以P＜0.05為篩選條件。其中GO分析包括細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子 功 能(molecular function,MF)、生 物 過 程(biological process,BP)。930個(gè)差異基因細(xì)胞組分主要集中在白細(xì)胞與細(xì)胞的粘附、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、巨噬細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)組織、白細(xì)胞遷移;分子功能主要集中在膜微區(qū)、膜筏、粘著斑、細(xì)胞-底物結(jié)、膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì);生物學(xué)過程主要集中在整聯(lián)蛋白結(jié)合、Toll樣受體結(jié)合、清道夫受體活性、受體活性、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分等(圖1B)。930個(gè)差異基因KEGG分析主要集中在IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、TNF信號(hào)通路、血管平滑肌收縮、細(xì)胞粘附分子、cGMPPKG信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、趨化因子信號(hào)通路等(圖1C)。

圖1 GSE147026差異基因篩選和相關(guān)生物學(xué)功能及信號(hào)通路分析Note. A, Screening of differentially expressed genes in AD and normal control tissues. B, GO enrichment analysis of differentially expressed genes. C, KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes.Figure 1 GSE147026 differentially expressed genes screening, related biological function and signal pathway analysis

2.2 AD主動(dòng)脈的免疫細(xì)胞構(gòu)成

研究根據(jù)材料和方法中描述的檢索詞,納入AD相 關(guān)mRNA轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 集:分 別 為GSE147026,4例正常主動(dòng)脈組織,4例AD組織。經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行矯正后,使用CIBERSORT對(duì)主動(dòng)脈血管內(nèi)細(xì)胞成分進(jìn)行注釋,并以條形圖顯示結(jié)果,其中不同顏色代表不同的細(xì)胞亞群(圖2A)。此外,GSE147026中(圖2B),幼稚B細(xì)胞(P=0.029)、M1巨噬細(xì)胞(P=0.044)在AD組織中表現(xiàn)出更高的浸潤(rùn)水平,活化NK細(xì)胞(P=0.055)在正常主動(dòng)脈組織表現(xiàn)出更高的浸潤(rùn)水平,M0(P=0.186)和M2(P=0.178)在AD組織中表現(xiàn)出較高的浸潤(rùn)水平,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其余細(xì)胞類型在正常主動(dòng)脈和AD中沒有顯著差異。

圖2 主動(dòng)脈夾層血管壁中細(xì)胞類型分析Note. A, Composition of different immune cell subpopulations in each sample. B, Different infiltration level of immune cell in AD tissue and normal aortic tissue.Figure 2 Analysis of cell types in the vessel wall of aortic coarctation

2.3 AD小鼠模型主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)

對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的主動(dòng)脈夾層形成,血管壁結(jié)構(gòu)完整,平滑肌細(xì)胞排列整齊;各實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈可見明顯擴(kuò)張及壁內(nèi)血腫;BAPN+Ang II組假腔中血細(xì)胞充盈,血管壁增厚,血管外膜中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較BAPN組和Ang II組明顯,BAPN組次之,Ang II組最輕(圖3)。

2.4 AD小鼠模型主動(dòng)脈巨噬細(xì)胞分布

為了深入研究BAPN、Ang II以及BAPN聯(lián)合Ang II誘導(dǎo)AD小鼠巨噬細(xì)胞極化情況。我們使用CD68和iNOS標(biāo)記M1型巨噬細(xì)胞,CD68和CD206標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞。小鼠主動(dòng)脈免疫熒光顯示,BAPN組M1型和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較Ang II浸潤(rùn)豐富,相對(duì)于BAPN+Ang II組較少(圖4A、4B),BAPN+Ang II誘導(dǎo)AD小鼠 M1型和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)最豐富(圖4C),對(duì)照組M1型和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)最少(圖4D)。

圖4 β-氨基丙腈聯(lián)合血管緊張素Ⅱ、β-氨基丙腈、血管緊張素Ⅱ 主動(dòng)脈夾層小鼠模型血管壁中M1、M2型巨噬細(xì)胞分布Note. A, Immunofluorescent staining of CD68 in normal control aorta tissues or AD tissues induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II. B,Immunofluorescent staining of CD206 in normal control aorta tissues or AD tissues induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II.Figure 4 Distribution of MI and M2 macrophage in AD tissue induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II

利用Western blot及ELISA進(jìn)一步檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈巨噬細(xì)胞表面marker及分泌蛋白,探究AD小鼠巨噬細(xì)胞極化情況(圖5A～5E)。研究發(fā)現(xiàn)iNOS(P=0.0007)、CD206(P=0.0020)、IL-6(P=0.0006)和IL-10(P=0.0001)蛋白表達(dá)在BAPN+Ang II誘導(dǎo)組表達(dá)相較對(duì)照組而言最高;iNOS(P=0.0006)、CD206(P=0.0265)、IL-6(P=0.0023)和IL-10(P=0.0002)蛋白表達(dá)在BAPN誘導(dǎo)組表達(dá)相較對(duì)照組而言高表達(dá),但較BAPN+Ang II誘導(dǎo)組表達(dá)較低;iNOS(P=0.0044)、CD206(P=0.0713)、IL-6(P=0.0639)和IL-10(P=0.0027)蛋白表達(dá)在Ang II誘導(dǎo)組表達(dá)相較對(duì)照組而言高表達(dá),但較BAPN+Ang II和BAPN誘導(dǎo)組表達(dá)均低。

注:紅色箭頭:主動(dòng)脈夾層病變部分。

圖5 β-氨基丙腈聯(lián)合血管緊張素Ⅱ、β-氨基丙腈、血管緊張素Ⅱ主動(dòng)脈夾層小鼠模型血管壁中M1、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物及分泌細(xì)胞因子分析Note. A～C, Immunoblot analysis of the protein expression of iNOS and CD206 in AD and normal aorta tissues. D～E, ELISA of cytokines in AD aorta tissues or normal aorta tissues homogenates. Compared with the corresponding group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 Expression of M1 and M2 macrophage marker in normal aorta tissues or AD tissues induced by BAPN+Ang II, BAPN and Ang II

3 討論

Ang Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要效應(yīng)肽,短時(shí)間內(nèi)可引起血管收縮,提高血壓,增加血流對(duì)血管壁的沖擊[11];誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(VSMC)過度肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度分泌,導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤(rùn),破壞血管,誘導(dǎo)主動(dòng)脈夾層的形成[12]。據(jù)Gavazzi以Tieu等[7]的報(bào)道,選用7～30Ⅱ周齡的雄性C57BL/6小鼠,微量緩釋泵灌注AngⅡ,其AD發(fā)生率分別為23%和25%。β-氨基丙腈(β-aminopropionitrile,BAPN)通過抑制膠原纖維的交聯(lián)來誘導(dǎo)主動(dòng)脈夾層[13],Van等[14]使用含0.25% β-氨基丙腈的飼料飼養(yǎng)小鼠,建立了小鼠AD模型,報(bào)道AD發(fā)生率為64.7%。本研究采用BAPN聯(lián)合Ang Ⅱ腹腔注射較文獻(xiàn)報(bào)道飼料喂養(yǎng)、給水灌胃在劑量方面更易控制;較微量泵而言,雖然不能模擬持續(xù)給藥過程,但每隔8 h給藥一次,操作更簡(jiǎn)單,造模費(fèi)用更低,無須特殊儀器。之后通過分析人AD組織轉(zhuǎn)錄組芯片以及體內(nèi)采用單獨(dú)Ang II、BAPN以及Ang II和BAPN聯(lián)合干預(yù)C57BL/6小鼠,探究不同干預(yù)情況下巨噬細(xì)胞在AD中的表型變化。

本研究通過分析AD相關(guān)轉(zhuǎn)錄組芯片,分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因中炎癥相關(guān)疾病的表達(dá)在AD組中顯著升高;GO分析發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞與細(xì)胞的粘附、巨噬細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)組織、白細(xì)胞遷移等介導(dǎo)炎癥相關(guān)細(xì)胞功能的差異基因富集均顯著升高,同時(shí)KEGG分析也提示差異基因中炎癥相關(guān)信號(hào)通路的富集也顯著增加,這些結(jié)果證明在AD發(fā)生中炎癥活化顯著增強(qiáng),提示炎癥在AD發(fā)生中扮演著重要的角色。本研究進(jìn)一步分析在AD發(fā)生中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量是否發(fā)生改變,通過探究發(fā)現(xiàn)包括單核/巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞在AD發(fā)生中浸潤(rùn)增加,其中M1型巨噬細(xì)胞在AD組織中的增加最為顯著,這進(jìn)一步確證了巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在AD的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

隨后我們通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證前期的分析結(jié)果。BAPN是賴氨酰氧化酶抑制劑,可誘導(dǎo)主動(dòng)脈壁囊性內(nèi)側(cè)變性[15],Ang II通過AT1受體,將巨噬細(xì)胞招募至主動(dòng)脈[16],分化為M1和M2型巨噬細(xì)胞,形成炎癥微環(huán)境[17],促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展。我們利用Ang II及BAPN構(gòu)建AD小鼠模型,發(fā)現(xiàn)AD小鼠模型中M1和M2型巨噬細(xì)胞均增高,BAPN+Ang II組最高,BAPN次之,Ang II最少。這些結(jié)果證明在AD發(fā)生發(fā)展中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加,進(jìn)一步提示巨噬細(xì)胞在AD的病理進(jìn)程中的重要介導(dǎo)作用。

Jain等[18]研究證實(shí),Ang II通過激活 JAK2/STAT5誘導(dǎo)血管平滑細(xì)胞的RANKL表達(dá),而巨噬細(xì)胞通過RANKL對(duì)動(dòng)脈瘤疾病的發(fā)展至關(guān)重要。Sun等[19]研究表明,炎癥可能是主動(dòng)脈瘤發(fā)病的常見機(jī)制,特別是,在主動(dòng)脈瘤患者的胸主動(dòng)脈樣本中普遍觀察到巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),但關(guān)于巨噬細(xì)胞在AD中的表型變化相關(guān)研究較少。血管修復(fù)與心血管疾病(CVD)、動(dòng)脈瘤、川崎病(KD)、主動(dòng)脈夾層(AD)、深靜脈血栓形成(DVT)等其他血管生成性疾病多種生理和病理過程相關(guān)[20]。血管新生在血管修復(fù)中往往涉及細(xì)胞增殖,遷移,分化,管形成和血管生成因子調(diào)控等過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可根據(jù)局部微環(huán)境信號(hào)分化為組織特異性巨噬細(xì)胞,包括M1(經(jīng)典激活)或M2(交替激活)兩個(gè)亞型。M1型巨噬細(xì)胞由脂多糖(LPS)或干擾素(IFN)-γ激活,在組織中發(fā)揮促炎作用,加劇組織損傷,其特異性標(biāo)記物包括誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)[21]。M2型巨噬細(xì)胞由IL-4、IL-13、免疫復(fù)合物、糖皮質(zhì)激素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β介導(dǎo)極化激活。在創(chuàng)傷愈合和組織重建中,M2型巨噬細(xì)胞釋放一系列抗炎產(chǎn)物發(fā)揮作用[22]。因此,我們的研究證實(shí)了不同表型巨噬細(xì)胞在AD組織中的浸潤(rùn)情況,M1/M2巨噬細(xì)胞共同作用,影響著AD的發(fā)展。我們提出假設(shè),在AD的發(fā)生中,M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥的發(fā)生,促進(jìn)AD的發(fā)展;M2型巨噬細(xì)胞的升高釋放抑炎因子,促進(jìn)組織的修復(fù),這可能是機(jī)體在病理?xiàng)l件下的一種代償性的保護(hù)機(jī)制。這也為后續(xù)的進(jìn)一步機(jī)制探究及靶點(diǎn)干預(yù)提供潛在的研究思路。

在這項(xiàng)研究中,AD小鼠主動(dòng)脈均有M1型和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),其中BAPN+Ang II組蓄積量最多。然而該項(xiàng)研究仍有一定的局限性,首先,基于動(dòng)物的模型不能完全模擬人中AD的發(fā)病機(jī)理。其次,我們不能排除其他炎癥細(xì)胞參與AD的誘導(dǎo)。綜上所述,通過本研究,我們建立了基于BAPN+Ang II腹腔注射高效誘導(dǎo)小鼠AD模型,這為研究后續(xù)AD的治療手段提供了有力的幫助。同時(shí),通過對(duì)機(jī)制的探究,我們初步發(fā)現(xiàn)了AD的發(fā)生和發(fā)展與M1和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)有著密切相關(guān),這也為后續(xù)深入研究AD的發(fā)病機(jī)制及其干預(yù)手段提供了理論支持。