陳利紅潘 萌鄭 捷徐牧遲

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科,上海 200025)

糖皮質激素(glucocorticoid,GC)主要用于類風濕關節(jié)炎患者,具有很好的療效,現階段GC已經成為臨床上最重要且應用最廣泛而有效的一種治療自身免疫性和炎癥性疾病的藥物。由于糖皮質激素在臨床上廣泛使用,2011年衛(wèi)生部頒布《糖皮質激素藥物臨床應用指導原則》來規(guī)范糖皮質激素在各科各種疾病上的應用[1]。臨床醫(yī)生通常應根據疾病情況、患者條件等綜合考慮風險/收益比來決定GC的使用時間、劑量、使用方法、藥劑劑型和強度等,而不當用藥會不同程度導致GC的副作用,給患者的健康甚至是生命帶來重大影響。常見的不良反應有Cushing綜合征,主要表現為肥胖、高血壓、糖尿病和血脂異常等特征[2-4]。長期使用GC患者會對心血管系統、肝系統、骨骼系統、中樞神經系統和眼部疾病等產生一定的副作用[5-7]。有研究發(fā)現,長期大面積外用強效GC的副作用顯著小于系統給藥。對于以皮膚為主要受累器官的疾病,例如大皰性類天皰瘡(一種主要累及老年人的嚴重的致死性自身免疫性水皰病[8]),大面積外用強效GC(0.05%丙酸鹵米松軟膏)導致的不良反應和死亡率也顯著小于系統給藥[9-10]。但長期大面積大量外用或系統應用GC導致的不良反應卻未見詳細報道。本文旨在探討長期大面積大量外用或系統應用GC(外用、口服、皮下注射)對小鼠代謝水平和主要臟器的影響,為進一步指導臨床合理利用GC治療患者提供線索和依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級KM小鼠共60只,雄性,體重32～35 g,8周齡,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2019-0009],常規(guī)飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院實驗動物科學部[SYXK(滬)2018-0027],飼養(yǎng)溫度20℃～24℃,相對濕度50%～60%,光照12 h明暗交替。研究經上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會審批(20180223)。所有實驗程序遵循上海交通大學醫(yī)學院瑞金醫(yī)院實驗動物保護和應用條例,飼養(yǎng)小鼠的過程中嚴格遵守3R原則并給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

0.05%鹵米松乳膏(澳能)(香港澳美制藥廠生產);醋酸潑尼松片(潑尼松,每片5 mg)(上海信宜制藥廠生產);2 mg/mL地塞米松磷酸鈉注射液(上海信宜制藥廠生產);尿素軟膏(上海市瑞金醫(yī)院制劑科)。血糖檢測儀及試紙(羅康全(Roche公司)活力型ACCU-CHEK Active);智能無創(chuàng)動物血壓計(日本SOFTRON公司BP-98A型);旋轉切片機(德國LAICA);光學顯微鏡(德國ZEISS);顯微圖像分析儀(SPOT software)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將實驗動物隨機分成4組,分別為正常對照組(NC組),0.05%鹵米松乳膏外用組(Halo組),潑尼松灌胃組(Pred組)和地塞米松皮下注射組(Dx組),每籠飼養(yǎng)5只小鼠。NC組和Halo組(外用GC組),實驗前以及每兩天小鼠背部30%體表面積用剃毛器除毛,NC組每只小鼠每天背部涂抹尿素軟膏1 g,Halo組每只小鼠每天背部涂抹0.05%鹵米松乳膏1 g。Pred組和Dx組為系統應用GC組,選用臨床最常用的潑尼松片和地塞米松磷酸鈉注射液。參考相關文獻中大劑量給藥法以及藥物效價[11],根據人-小鼠體表面積換算公式[12],將人體使用糖皮質激素劑使用劑量換算為小鼠使用劑量(見表1)。Pred組將醋酸潑尼松片溶于0.9%氯化鈉溶液,給予每只小鼠6 mg/(kg·d)灌胃給藥,Dx組每只小鼠在大腿根部皮下注射0.9 mg/(kg·d)地塞米松磷酸鈉注射液。

表1 人體與小鼠激素使用劑量換算Table 1 Dose conversion between human and mice

1.3.2 小鼠體重測量

每周用電子天平對小鼠稱重并記錄小鼠體重。

1.3.3 小鼠血壓測量

在實驗開始第0月、第3月和第6月用無創(chuàng)血壓計檢測小鼠心率(HR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP),并計算平均動脈壓(MAP),計算公式為:MAP=(SBP+DBP ×2)/3。

1.3.4 小鼠空腹毛細血管血糖(FCBG)和口服糖耐量(OGTT)測量

分別在實驗第0月、第3月和第6月,將小鼠禁食6 h后,在鼠尾取血測FCBG并記錄。實驗第3月和第6月給予葡萄糖2.0 g/kg灌胃,分別于灌胃前,灌胃后15 min、30 min、1 h和2 h分別割尾取血測定OGTT,并觀察各組小鼠在給予葡萄糖后各時間點血糖曲線下面積(AUCg)的變化。血糖曲線下面積計算公式:AUCg(mmol/L·h)=(7.5 × 0 min血糖值+15 × 15 min血糖值+22.5 × 30 min血糖值+45 × 60 min血糖值+30 × 120 min血糖值)/60。

1.3.5 小鼠器官組織病理學檢測

實驗結束后解剖實驗小鼠,采集心臟和肝組織各一塊,將各組織標本用PBS溶液沖洗后經4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色(HE染色),送至上海交通大學醫(yī)學院病理生理學教研室與上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院病理科,分別在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.4 統計學方法

所有的資料應用SPSS 21.0進行統計學分析,GraphPad Prism 6.0制圖。所有計量資料平均數±標準差(±s)表示,比較兩個計量資料運用t檢驗,兩個以上的計量資料方差分析(One way ANOVA),并用LSD或Tamhane法依據方差齊性進行事后檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體重的變化

各組小鼠平均體重在實驗開始前未見明顯差異。實驗第1個月起,Pred組和Dx組與NC組相比差異有顯著性(P＜ 0.05);隨著時間的延長,在第3月與第6月Pred組和Dx組小鼠體重增長更明顯,較NC組具有顯著統計學意義(P＜0.001);Pred組和Dx組之間,Halo組與NC之間比較無顯著性差異(P＞0.05),見表2。

表2 各組小鼠各時間點平均體重(±s,n=5)Table 2 Body weight of the mice in each group

表2 各組小鼠各時間點平均體重(±s,n=5)Table 2 Body weight of the mice in each group

注:與正常對照組相比, *P＜0.05,***P＜0.001。Note. Compared with NC group, *P＜0.05, ***P＜0.001.

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2.2 小鼠心率(HR)和平均動脈壓(MAP)的變化

實驗前各組之間HR無明顯差異。實驗第6月,Halo組、Pred組和Dx組的HR與同組用藥前相比明顯加快,差異具有顯著性(P＜0.05),其中Pred組最為顯著(P＜0.001),表明口服潑尼松對小鼠HR有明顯刺激作用;NC組實驗前后HR無顯著差異(P＞0.05),見表3。

表3 各組小鼠實驗前和實驗第6月HR變化(±s,n=5)Table 3 Heart rate before and at 6thmonth

表3 各組小鼠實驗前和實驗第6月HR變化(±s,n=5)Table 3 Heart rate before and at 6thmonth

注:與同組別實驗前心率比較, *P＜0.05,***P＜0.001。Note. Compared with the HR of the same group before treatment, *P＜0.05, ***P＜0.001.

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如表4,各組用藥之前組間MAP均無明顯差異。隨著用藥時間增長,實驗第6個月時各組的MAP值均明顯升高,與同組用藥前的MAP 相比,具有統計學差異(P＜0.05)。其中,Pred組MAP升高最為顯著,與NC組和Halo組相比,差異也具有顯著性(P＜0.05);Dx組MAP值與Halo組相比也有顯著差異(P＜0.05)。

表4 各組小鼠實驗前和實驗第6月MAP變化(±s,n=5)Table 4 MAP before and at 6thmonth

表4 各組小鼠實驗前和實驗第6月MAP變化(±s,n=5)Table 4 MAP before and at 6thmonth

注:組內對比,與實驗前MAP比較, *P＜0.05;與正常對照組相比, #P＜0.05;與鹵米松外用組相比,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01。Note. Compared with the MAP of the same group, *P＜0.05. Compared with NC group, #P＜0.05. Compared with Halo group,ΔP＜0.05, ΔΔP＜0.01.

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2.3 小鼠FCBG的變化

由表5可見,實驗前與實驗第3月,各組小鼠間FCBG組間相比無統計學差異。實驗第6個月,NC組、Halo組和Dx組小鼠FCBG均有不同程度下降,與實驗前同組的FCBG對比,差異有統計學意義(NC組P＜0.05,Halo組P＜0.05,Dx組P＜0.001),NC組和Dx組與同組第3個月FCBG對比,也具有差異顯著性(NC組P=0.001,Dx組P＜0.001)。而Pred組在實驗第6個月時FCBG為(9.20±1.1692)mmol/L,與同組在實驗前和實驗第3月相比無明顯差異(P＞0.05),但與第6月的NC組、Halo組和Dx組的FCBG相比,Pred組的FCBG顯著性升高(P＜0.05),表明口服潑尼松可能具有升高血糖的作用。

表5 小鼠FCBG變化(±s,n=5)Table 5 Change of FCBG during the study

表5 小鼠FCBG變化(±s,n=5)Table 5 Change of FCBG during the study

注:與同組別實驗前FCBG相比, *P＜0.05, **P＜0.01;與同組別第3月FCBG相比,ΔP＜0.05;與正常對照組、鹵米松外用組以及地塞米松皮下注射組第6月FCBG相比, #P ＜0.05。Note. Compared with the FCBG of the same group before the study, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with the FCBG of the same group at 3rd month,ΔP＜0.05. Compared with the FBCG at 6th month with NC, Halo and Dx group, #P＜0.05.

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2.4 小鼠OGTT的變化和血糖曲線下面積(AUCg)

在實驗前和實驗第3月,OGTT各組之間的各個時間點無統計學差異,AUCg各組組間亦無統計學差異。實驗第6月,Pred組在0 min與15 min血糖濃度與Halo組相比顯著升高(P＜ 0.05),但與NC組以及Dx組相比無明顯差異;在第30 min、60 min和120 min與其余3組相比小鼠血糖也無統計學差異,表明Pred組小鼠瞬時血糖升高較快。同時,Pred組AUCg最高,與Halo組相比有差異顯著性(P＜0.05),表明口服潑尼松后小鼠血糖清除能力降低,結果見表6。

表6 實驗第6月小鼠OGTT以及AUCg(±s,n=5)Table 6 OGTT and AUCg of the mice at 6thmonth

表6 實驗第6月小鼠OGTT以及AUCg(±s,n=5)Table 6 OGTT and AUCg of the mice at 6thmonth

注:與鹵米松外用組相比, *P＜0.05。Note. Compared with Halo group, *P＜0.05.

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2.5 心臟組織觀察

通過HE染色結果顯示,NC組心肌細胞形態(tài)正常,未見明顯心肌損害;Halo組有5/10表現為輕度心壁內心肌細胞間脂肪浸潤,個別心肌細胞小泡性脂肪變性;Pred組大部分出現輕度心肌間脂肪浸潤(8/10),并且同時出現了輕度的細胞變性(8/10);Dx皮下注射組病理損傷程度最重,呈輕度至中度脂肪浸潤與細胞變性,并有2張呈重度心壁內心肌細胞間脂肪浸潤,部分片灶性脂肪浸潤在心肌間質血管周圍加強,結果見表7和圖1。

表7 各組小鼠心肌的病理學分級(n=10,張)Table 7 Cardiomyocyte classification (pieces)

圖1 各組小鼠心肌的病理照片(HE染色)Note. A, NC group. B, Halo group. C, Pred group. D/E, Dx group.Figure 1 Pathological photos of myocardium of mice in each group (HE staining)

2.6 肝組織觀察

通過HE染色結果顯示,NC組中可見少于一半的切片呈現輕度脂肪浸潤;Halo組異常組織切片(6/10)可見彌漫性肝細胞小空泡變性,星形細胞輕度至中度肥大,顯示脂肪增多;Pred組均可見輕至中度星形細胞肥大,脂肪浸潤(10/10),并伴有多數點狀壞死灶和炎性細胞浸潤,其中有2只小鼠切片呈重度損傷,伴有小葉結構破壞;Dx組肝損傷程度與Pred組相似,亦有2張切片可見重度損害,其一甚至可見星形細胞彌漫性增生,累及全部肝組織,增生的星形細胞明顯肥大,胞漿富含脂肪空泡,伴炎癥細胞浸潤,肝細胞多受壓而萎縮,部分肝細胞也發(fā)生脂肪變性,肝小葉結構部分破壞,結果見圖2。

圖2 各組小鼠肝病理照片(HE染色)Note. A, NC group. B, Halo group. C, Pred group. D, Dx group.Figure 2 Pathological photos of mice liver in each group (HE staining)

病理分級評分可見Halo組肝組織損傷輕微,與NC組相比無統計學差異;系統應用GC組肝組織呈現明顯的細胞變性、脂肪浸潤、細胞壞死、炎細胞浸潤,與外用GC組相比,有統計學差異,表明系統應用GC組對小鼠肝的損傷大于外用GC組,且主要呈現脂肪代謝障礙以及炎癥浸潤等表現,結果見表8與表9。

表8 各組小鼠肝的病理學分級(n=10,張)Table 8 Hepatic pathology classification (pieces)

表9 各組小鼠肝病理分級評分(±s,n=10)Table 9 Hepatic pathology grading score

表9 各組小鼠肝病理分級評分(±s,n=10)Table 9 Hepatic pathology grading score

注:-:0分;+:1分;++:2分;+++:3分。與正常對照相比, *P＜0.05, **P＜0.01,***P＜ 0.001;與鹵米松外用組相比,ΔP＜0.05,ΔΔP＜0.01,ΔΔΔP＜0.001。Note.-, 0 point. +, 1 point. ++, 2 points. +++, 3 points. Compared with NC group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.Compared with Halo group, ΔP＜0.05, ΔΔP＜0.01, ΔΔΔP＜0.001.

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3 討論

對于外源性給予GC后小鼠體重的變化目前尚無定論,大多數報道傾向于口服GC誘發(fā)小鼠肥胖[13-14],而種植皮質酮緩釋片或腹膜內注射GC可能導致小鼠體重下降[15-17]。本研究在第一月外用鹵米松組小鼠體重較對照組更輕,與本課題組早前的實驗結果相符,即外用鹵米松有輕度的體重抑制作用[18],但到實驗第6個月時外用鹵米松組與對照組小鼠體重并無統計學差異,即長期外用鹵米松對小鼠體重沒有明顯影響。本研究結果同時也表明系統用藥組即潑尼松灌胃組和地塞米松皮下注射組較對照組小鼠體重有明顯增長,同時兩組系統用藥組小鼠體重在各時間段相比沒有差異。已有文獻報道,口服GC 28 d小鼠體重增加加快[14,19],本實驗結果與之相符的同時也證明,更長時間口服(6個月)GC的小鼠體重仍繼續(xù)呈快速增長的趨勢。此外,不同于通過腹膜內給藥或皮下種植皮質醇緩釋片給藥后導致小鼠體重下降,本實驗中地塞米松皮下注射組小鼠體重亦增長明顯,這可能與給藥方式相關。且本實驗中給藥濃度較其余已報道的研究實驗更高,故可在后期實驗中進一步探究不同劑量與不同給藥方式對小鼠體重的影響。

對于長期外用或系統應用糖皮質激素對小鼠血壓及心率的影響,已有研究報道大約20%長期使用外源性激素的患者出現了高血壓[20],并且高血壓的發(fā)病率與GC的使用劑量呈正相關[21]。還有研究指出GC與鹽皮質激素有相似作用,能夠結合腎臟鹽皮質受體,加速水鈉潴留進而升高血壓[22]。與此相一致,本實驗證明了長期外用或系統應用GC后小鼠平均動脈壓均較用藥前明顯升高,系統用藥組平均動脈壓升高的差值百分比明顯高于外用組,且具有顯著統計學差異。本研究還對比了試驗前后小鼠的心率,結果發(fā)現無論是長期外用還是系統應用糖皮質激素,都會導致小鼠心率明顯加快,其中潑尼松灌胃組心率升高最為顯著。

對于糖皮質激素對小鼠糖代謝水平的影響,最近一項Meta分析報道,對小鼠模型短期或長期系統給藥甲強龍可以誘導小鼠肝糖類代謝功能異常[23]。還有研究表明使用GC治療的患者得糖尿病的幾率是正常人的2.23倍[24],給有糖尿病的患者使用GC會使血糖升高,給沒有糖尿病的患者使用高劑量GC也很大可能會出現高血糖[25]。本研究結果證明,小鼠口服潑尼松具有升高血糖的作用,特別是口服藥物后至15 min的時間血糖升高的作用非常顯著;同時,口服潑尼松后血糖清除能力降低,這進一步導致血糖的升高,與其余3組的血糖水平相比具有顯著的統計學差異。但是也有研究報道,短期和長期皮下注射地塞米松不會引起SD大鼠的血糖升高,反而會導致血糖的降低[18],這可能是由于地塞米松通過胰島β細胞肥大和前體細胞的新生而增加胰島β細胞體積,從而增加胰島素分泌[26],維持血糖的平衡或者降低血糖。本實驗結果與此相一致,皮下注射地塞米松組小鼠的血糖相比對照組也沒有明顯升高。由此可見,長期外用糖皮質激素對小鼠糖代謝沒有明顯影響,而長期系統應用糖皮質激素在可能會引起糖代謝異常,但需要針對特定的激素類藥物進行針對性的分析與研究。

對于糖皮質激素對小鼠臟器的影響,報道發(fā)現一位先天性腎上腺皮質增生癥的24歲女性患者,接受了為期12年的地塞米松治療后,肝酶異常,肝活檢病理切片發(fā)現有繼發(fā)性脂肪肝病改變[27]。還有文獻認為長期使用GC可以對心血管系統造成損害,會引起左心室肥大和纖維化等心室重構現象,導致收縮壓升高、心率減緩、心室輸出率降低等[26]。本研究對小鼠器官進行病理切片并檢測,結果與上述研究結論相一致,長期外用或系統應用糖皮質激素會引起小鼠肝和心臟可見程度不同的損害,主要表現為脂肪浸潤和細胞變性,其中外用GC組臟器損傷較輕,系統應用GC組臟器損傷較重,肝損傷主要表現為明顯的細胞變性、脂肪浸潤、細胞壞死、炎細胞浸潤,特別是地塞米松皮下注射組還出現了肝小葉結構部分破壞;心臟損傷主要表現為心壁內心肌細胞間脂肪浸潤,地塞米松皮下注射組部分片灶性脂肪浸潤在心肌間質血管周圍加強。小鼠心肌的損害主要涉及脂肪代謝,可能與小鼠代謝功能異常有關。部分切片可見心肌細胞變性,可能與血壓和心率變化等心功能改變有關,但未見到心肌細胞肥大與纖維化等器質性變化。

綜上所述,長期外用鹵米松乳膏要比系統應用潑尼松和地塞米松對小鼠的代謝水平以及對心臟、肝的臟器損害副作用小,安全性高,而系統應用GC尤其是口服潑尼松對小鼠代謝水平的影響最大,會造成小鼠體重、心率、血壓以及血糖代謝等水平紊亂,且對小鼠心臟、肝等器官損傷明顯,主要表現是心臟和肝的脂質沉積病變。本研究結果為進一步指導臨床合理利用糖皮質激素治療患者提供線索和依據。