王靈銳 叢珊 王鈺銘 張晨曦 羅劍 羅莉（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性自身免疫性疾病，主要病理表現(xiàn)為持續(xù)性多關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)、進(jìn)行性的軟骨和骨骼的破壞甚至關(guān)節(jié)功能喪失［1］。RA在成年人群中的患病率為0.5%～1%，以女性患者居多［2］。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中滑膜組織增生是引起RA軟骨和骨骼破壞的最重要因素。最新研究發(fā)現(xiàn)，滑膜成纖維細(xì)胞自噬紊亂是RA的重要發(fā)病機(jī)制之一，在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型中，滑膜成纖維細(xì)胞（RA synovial fibroblasts，RASFs）自噬水平升高，進(jìn)而促進(jìn)其增殖，最終導(dǎo)致滑膜增生，通過抑制滑膜組織自噬水平可減輕滑膜增生［3］。天山雪蓮（sasussured involucrata，SI）是中國(guó)新疆天山西部地區(qū)的稀有草本植物，多年來常用于RA的治療［4］。天山雪蓮口服液（SI Oral Liquid，SIOL）主要由SI提取物組成，目前已廣泛應(yīng)用于RA的臨床治療，在改善RA患者關(guān)節(jié)疼痛、晨僵、關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)壓痛方面效果明顯［5］，然而其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過建立CIA大鼠模型，從調(diào)節(jié)自噬角度，進(jìn)一步探討SI治療RA的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，鼠齡6～7周，體質(zhì)量（200±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2主要試劑與儀器天山雪蓮口服液（新疆天山蓮藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20190901）；雷公藤多苷片（黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)：20200901）；牛源性Ⅱ型膠原蛋白（bovine typeⅡcollagen，CⅡ，Chondrex，Inc公司，批號(hào)：#20022）；弗氏完全佐劑（Sigma公司，CFA，批號(hào)：#SLCC6223）；JNK抗體、p-JNK抗體（Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：#9252、#4668）；Bcl-2抗 體（Abcam公 司，批 號(hào)：ab59348）；Beclin-1抗體、LC3-Ⅱ抗體、β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（Proteintech公司，批號(hào)：

11306-1-AP、14600-1-AP、20536-1-AP、SA00001-2）；BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶公司，批號(hào)：No.20210419）；TG15高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；JY600C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2方法

1.2.1CIA模型制備大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將CⅡ以2 mg/ml溶解于0.05 mol/L的乙酸中，并在等體積的CFA中乳化，以200 μl乳劑在足趾及尾根部1.5 cm處皮下注射進(jìn)行初次免疫，初次免疫7 d后再次經(jīng)皮下注射相同乳劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫，進(jìn)而誘發(fā)CIA大鼠模型［6］。加強(qiáng)免疫后15 d（即初次免疫第21天）開始觀察并記錄關(guān)節(jié)病變程度，大鼠出現(xiàn)包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹提示造模成功。

1.2.2分組及給藥將50只大鼠平均分為健康對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、SIOL低、高劑量組。除健康對(duì)照組外，其余各組采用CⅡ建立CIA模型，造模成功后，空白組和陰性對(duì)照組灌胃生理鹽水（2 ml/d），陽性對(duì)照組灌胃雷公藤多苷片［20 mg/（kg·d）］［7］，SIOL低、高劑量組灌胃分別灌胃SIOL（0.5 ml/d、2.0 ml/d），共給藥28 d。注：SIOL給藥劑量根據(jù)人等效劑量換算公式得到，其中低劑量組為人等效劑量。

1.2.3觀察大鼠一般情況并測(cè)量踝關(guān)節(jié)腫脹度

分別在造模前、給藥第0天、第7天、第14天、第21天、第28天用游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左后踝關(guān)節(jié)直徑，連續(xù)測(cè)量3次，取其平均值。腫脹度（%）=（dn-dt）/dt×100%，dt、dn分別代表致炎前后踝關(guān)節(jié)直徑。

1.2.4HE染色觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)表現(xiàn)

取大鼠踝關(guān)節(jié)，于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后置于10%的EDTA溶液進(jìn)行關(guān)節(jié)脫鈣，脫鈣完成后梯度濃度乙醇脫水，經(jīng)包埋、切片、烘干、脫蠟、HE染色等步驟后，×100顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)病理改變。

1.2.5qPCR測(cè)定滑膜組織中JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA含量取大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織30 mg提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，按照試劑盒說明分別加入引物和SuperReal PreMix Plus等，qPCR反應(yīng)條件：95℃15 min，95℃20 s，56℃20 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析：溫度62～95℃，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

1.2.6Western blot檢測(cè)滑膜組織中JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)收集各組大鼠的膝關(guān)節(jié)滑膜組織，稱取約20 mg，加入150 μl RIPA蛋白裂解液，勻漿離心后留取蛋白。采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣品取等量蛋白10 μg，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，電泳條件：90 V，20 min；130 V，1 h。隨后以130 V、300 mA、2 h將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入不同的兔抗大鼠一抗JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3、β-actin（稀釋比例分別為1∶10 000、1∶10 000、1∶1 000、1∶10 000、1∶2 500、1∶5 000）4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗（羊抗兔IgG按1∶9 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)，采用Image pro plus 6.0軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行量化分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料間較符合正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，以±s表示，兩組間資料比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SIOL對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響與健康對(duì)照組相比，灌胃后第7、14、21、28天陰性對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹顯著升高（P＜0.01）；與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組、SIOL低、高劑量組在灌胃后第21、28天可顯著抑制CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 SIOL對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響Fig.1 Effect of SIOL on swelling degree of ankle in CIA rats

2.2SIOL對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)損傷程度的影響HE染色結(jié)果顯示，健康對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)軟骨、骨組織無破壞，關(guān)節(jié)面光滑，滑膜組織內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；陰性對(duì)照組大鼠滑膜組織明顯增生嵌入關(guān)節(jié)腔，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組大鼠滑膜組織增生顯著降低，趨于正常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；SIOL低劑量組各病變改善不明顯；SIOL高劑量組滑膜組織增生顯著減輕，關(guān)節(jié)腔嵌入程度明顯改善，炎癥細(xì)胞明顯減少（圖2）。

圖2 SIOL對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)影響（HE，×100）Fig.2 Effect of SIOL on histopathology of ankle in CIA rats（HE，×100）

2.3SIOL對(duì)CIA大 鼠JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA表達(dá)的影響與健康對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）；與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組和SIOL低、高劑量組JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3mRNA表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），見圖3。

圖3 SIOL對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of SIOL on mRNA expressions of JNK，Bcl-2，Beclin-1 and LC3 mRNA in synovial tissues of CIA rats

2.4SIOL對(duì)CIA大鼠滑膜組織中JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)JNK/Bcl-2/Beclin-1通路相關(guān)因子JNK、p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明：與健康對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ相對(duì)蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）；與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組、SIOL低、高劑量組p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ相對(duì)蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），各組JNK水平無明顯差異，見圖4。

圖4 SIOL對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織JNK、p-JNK、Beclin-1、Bcl-2、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of SIOL on protein expressions of JNK，p-JNK，Beclin-1，Bcl-2，LC3-Ⅱin synovial tissues of CIA rats

3 討論

CIA大鼠是目前研究RA常用的動(dòng)物模型，其主要病理表現(xiàn)為滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、軟骨破壞和骨侵蝕，這些病理學(xué)表現(xiàn)與RA相一致［8］。本研究中大鼠注射CⅡ21 d后，大鼠表現(xiàn)出關(guān)節(jié)腫脹度增加，HE染色滑膜組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這些表現(xiàn)與既往研究報(bào)道一致［8］，提示造模成功。SIOL能減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜增生，減緩RA的關(guān)節(jié)破壞［9］。雷公藤多苷片具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎等作用，是一種常用的RA治療藥物［10］。本研究選取雷公藤多苷片為陽性對(duì)照，結(jié)果表明SIOL高劑量組與陽性對(duì)照組之間JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3的表達(dá)水平差異較小，提示SIOL可作為雷公藤多苷片的替代療法治療RA。

自噬是一種重要的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，通過降解細(xì)胞內(nèi)病原體、受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集體來維持細(xì)胞和組織的穩(wěn)態(tài)和完整性［11］。最近的研究表明，自噬與RA滑膜成纖維細(xì)胞（RASFs）有關(guān)［12］。生理情況下，RASFs自噬處于較低水平，病理情況下，RASFs自噬水平升高進(jìn)而導(dǎo)致滑膜增生，加重RA病程［13］。JNK/Bcl-2/Beclin-1通路是自噬啟動(dòng)的重要途徑，c-Jun氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，JNK被磷酸化激活后，導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2活化，使Beclin-1從Bcl-2-Beclin-1復(fù)合物解離，游離的Beclin-1可啟動(dòng)自噬過程，使胞質(zhì)形式的LC3（LC3-Ⅰ）通過與磷脂酰肌醇結(jié)合形成膜結(jié)合形式的LC3（LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ逐漸聚集并定位于自噬體膜上直到與溶酶體融合［14-15］。RA模型大鼠滑膜組織中自噬通路顯著上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致滑膜增生［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組關(guān)節(jié)滑膜組織中p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)水平均高于健康對(duì)照組，提示RA大鼠JNK/Bcl-2/Beclin-1通路被激活，自噬水平升高。SIOL灌胃28 d后，RA大鼠p-JNK、Bcl-2、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)水平均下降，提示SIOL干預(yù)后，RA大鼠JNK/Bcl-2/Beclin-1通路被抑制，細(xì)胞的自噬活動(dòng)降低，從而改善RA癥狀。

綜上所述，SIOL對(duì)CIA大鼠有一定的治療作用，其機(jī)制可能與抑制JNK/Bcl-2/Beclin-1通路活性，進(jìn)而抑制滑膜組織自噬有關(guān)。