鼻咽癌是一種發(fā)病原因不明的上皮惡性腫瘤，是我國耳鼻咽喉惡性腫瘤的主要致死因素。中國人群的鼻咽癌死亡率（0.012‰）顯著高于世界平均水平（0.007‰），位居全球鼻咽癌死亡率的第23位。目前臨床仍以放療作為鼻咽癌早期治療的有效手段。不可否認的是放療在鼻咽癌前期治療中占據(jù)主導地位，然而放療后局部復發(fā)和遠處轉移是目前常見的治療失敗的主要原因，即使盡可能的提高治療精度和化療密集度，但是對于晚期病人仍未取得良好的療效。聯(lián)合治療成為了治療局部晚期疾病的重要手段，同時許多實驗也表明晚期鼻咽癌聯(lián)合治療比單純放療或化療的生存率更高。近年來，靶向藥物治療鼻咽癌顯示出了非同尋常的效果，它有著相對于放化療副作用小的優(yōu)點，已成為治療鼻咽癌的研究熱點。因此尋找有效的靶向藥物是亟待解決的問題。

表皮生長因子受體(EGFR)屬于糖蛋白，在調節(jié)細胞生理功能方面具有重要作用，相關研究已證實鼻咽癌、肺癌、結直腸癌以及乳腺癌的轉移、增殖與EGFR的表達密切相關，AZD9291是一種高效選擇性EGFR突變體抑制劑，主要用于存在EGFR T790M突變陽性的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌，臨床顯示出良好的抗腫瘤活性；亦有研究表明，AZD9291通過誘導細胞凋亡而表現(xiàn)出強大的抗結直腸癌效果。由于EGFR在鼻咽癌患者中高表達，因此我們期待拓展其在其他腫瘤中的應用。然而，AZD9291對鼻咽癌細胞體外生長的影響、是否能夠抑制細胞轉移以及具體的抗腫瘤機制尚無文獻報道。本研究以三代EGFR-TKI AZD9291 為研究對象，觀察其對鼻咽癌HNE1 和CNE2Z細胞的增殖抑制作用以及對細胞遷移能力的影響，并探討相關可能機制，為開辟鼻咽癌的臨床治療途徑提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人鼻咽癌HNE1 和CNE2Z 細胞（普諾賽），RPMI 1640細胞培養(yǎng)液（賽默飛），PBS（塞維爾），胎牛血清（四季青），胰酶（Biosharp），PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Vimentin 抗體（CST），Ecadherin 抗體（Proteintech），EGFR、p-EGFR 抗體(Abcam)，CCK8、Transwell小室、青霉素-鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自合肥志宏泰克生物技術有限公司，MHY-1485、AZD9291（MCE）。

我國社會主義建設面臨著紛繁復雜的局勢，創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)離不開對基本國情、國家政策、經濟社會轉型、國內外形勢的理解。只有充分理解政治、經濟發(fā)展的趨勢，才能找準創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的切入點，保證創(chuàng)業(yè)朝著正確方向前進。在創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育中融入批判性思維，有助于提高大學生的政治素養(yǎng)和明辨是非的能力，培養(yǎng)時事敏感度，讓他們有能力參與到經濟、政治生活中來。培養(yǎng)大學生的批判性思維，有助于提高他們獨立的思考能力、思辨能力、解決問題的能力，提高他們理解和消化國家政策的能力，使他們能主動進行信息的識別、選擇與理解，最后做出合理、有依據(jù)的判斷，從而保證創(chuàng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1.2 細胞培養(yǎng)

HNE1 和CNE2Z 細胞使用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

CCK8 結果顯示，HNE1 細胞在0、0.5、1、2、4、8 μmol/L 的AZD9291 作用下增殖受到明顯抑制；CNE2Z細胞在0、1、2、4、8、16 μmol/L的AZD9291作用下增殖受到明顯抑制。隨著藥物處理時間的增加抑制作用增加（圖1A）。分別使用較低濃度AZD9291（0、0.5、1、2 μmol/L）處理HNE1和CNE2Z細胞，觀察集落克隆形成。結果顯示HNE1 和CNE2Z 細胞在AZD9291的作用下增殖受到明顯抑制，隨著給藥濃度的增加抑制作用增加（圖1B）。

1.3 CCK8實驗

將HNE1和CNE2Z細胞以5×10/孔種植于96孔板，24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)基，HNE1細胞加入含有濃度分別為0、0.5、1、2、4、8 μmol/L的AZD9291的新鮮培養(yǎng)液，CNE2Z細胞加入含有濃度分別為0、1、2、4、8、16 μmol/L 的AZD9291 的新鮮培養(yǎng)液。分別在給藥24、48、72 h后吸出培養(yǎng)基，加入含有CCK8試劑的新鮮培養(yǎng)基（按照1 mL 培養(yǎng)基100 μL CCK8 的比例混勻），放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后，使用酶標儀檢測值。

1.4 細胞劃痕實驗

使用STLINK 作為仿真器，當LDC1000 檢測到存在金屬或硬幣時，它會比較檢測到的數(shù)據(jù)。然后，在軟件中設置改變閾值以區(qū)分和識別導線和硬幣的閾值，并且設置硬幣閾值是700。

1.5 集落克隆實驗

將處于對數(shù)生長期的HNE1和CNE2Z細胞以1×10/孔種植于6孔板中，分別加入含有0、0.5、1、2 μmol/L AZD9291的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)到14 d或絕大多數(shù)單克隆細胞數(shù)大于50為止，用PBS沖洗后用4%多聚甲醛進行固定30 min，后用PBS沖洗，再加入結晶紫進行染色20 min，用PBS沖洗數(shù)次，晾干。

1.6 遷移實驗

隨著給藥濃度的增加E-cadherin的表達明顯的增加。Vimentin蛋白表達隨著藥物濃度的增加而降低。（圖5）。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達水平

Western blot 結果顯示，AZD9291 對HNE1 和CNE2Z細胞的EGFR、PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化均有抑制作用并隨著給藥濃度的升高抑制作用不斷增強（圖2）。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS21.0軟件對實驗結果進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析評價實驗組間的差異，＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

將HNE1和CNE2Z細胞以5×10/孔種植于6孔板中，放置于37 ℃、5%CO飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞長滿后，用200 μL的移液器吸頭垂直均勻劃線，用PBS沖洗3次，分別加入含有0、0.5、1、2 μmol/L AZD9291的無血清培養(yǎng)液，分別在0 h和24 h用光學顯微鏡進行拍照，后使用ImageJ進行計算分析。

2 結果

2.1 AZD9291對HNE1和CNE2Z細胞的增殖抑制作用

目前，絕大多數(shù)員工所使用的手機都是智能手機，完全能夠滿足員工所需的各種E-training 形式，包括文字、視頻、動畫、聯(lián)網、信息下載以及互動等各種功能。但由于通過手機開展E-training 是一個新生事物，不但作為發(fā)起方的企業(yè)處于探索階段，而且作為接受方的員工也需要認知和適應過程，因此，實施手機E-training，應本著先易后難、循序漸進的原則，逐步探索適于本組織的最佳培訓模式。

2.2 AZD9291對EGFR信號通路的影響

將細胞以一定密度種植于100 mm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，分別更換為含有0、2、4、8 μmol/L AZD9291的新鮮培養(yǎng)液，24 h后收集細胞并用RIPA裂解液，冰上裂解30 min，放入-20 ℃冷藏過夜，后置于12 000 r/min，4 ℃，離心30 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒定量后，調齊蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳法，電壓為80 V至各孔穿過上層膠后，調整電壓為120 V，直至蛋白跑至底部，后以200 mA 恒流轉移至PVDF 膜上。轉膜結束后，使用快速封閉液封閉30 min，用TPBS洗膜3次，放置一抗中4 ℃孵育過夜，TPBS洗膜3次，放入二抗中室溫下孵育2 h，用TPBS洗膜3次，配置ECL顯影液，浸潤PVDF膜，凝膠成像系統(tǒng)進行顯色拍照。

與對照組相比，隨著給藥濃度的增加，HNE1 和CNE2Z劃痕愈合能力明顯下降（圖3），Transwell小室遷移實驗結果顯示給藥后明顯降低了細胞的遷移數(shù)量（圖4）。

2.3 AZD9291對HNE1和CNE2Z細胞遷移能力的影響

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2.4 AZD9291對HNE1和CNE2Z細胞遷移相關蛋白的影響

消化離心后收集HNE1和CNE2Z細胞，用無血清培養(yǎng)基重懸混勻后計數(shù)。向每個小室中加入含有2×10細胞的無血清細胞懸液100 μL，Transwell 下室加入600 μL含血清培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，用PBS清洗，放入4%多聚甲醛中固定15 min，擦去小室內的細胞，用結晶紫染色15 min，用PBS清洗后自然晾干，置于光學顯微鏡下觀察。

2.5 激活mTOR對AZD9291抑制HNE1和CNE2Z細胞遷移的影響

使用AZD9291 和mTOR 激活劑MHY-1485（10 μmol/L）作用于HNE1和CNE2Z細胞后，MHY-1485對細胞的遷移能力無明顯影響，但可以部分逆轉AZD9291對細胞的遷移能力抑制作用（圖6）。

3 討論

臨床治療鼻咽癌的方式主要為放療和化療。近幾年，盡管治療方案有較多進展，但是局部復發(fā)或遠處轉移常常導致治療失敗，這也使得鼻咽癌的晚期治療效果不佳。相關研究已證實鼻咽癌患者接受靶向治療可引起持久性的臨床反應，有望成為個體化治療的重要組成部分。

高效課堂是對傳統(tǒng)課堂的優(yōu)化與改進，它以學生為中心，以快樂為根本，在初中數(shù)學的教學過程中應用廣泛。本文結合多年教學經歷與實踐，得出教師應該在提高學習興趣與學習習慣，教學內容與活動，課后的探究性學習三個方面來提高課堂的有效性，不僅可以實現(xiàn)教師少教、學生多學的高效課堂模式，幫助學生從低效學習到高效學習再到終身學習的轉變，還能促進學生創(chuàng)新思維、合作探究等各方面品質的形成，實現(xiàn)師生互動、生生互動的雙向交流過程。教師在以后的初中數(shù)學過程中，還應不斷探索高效課堂的教學模式，找到適合教學的最佳方案，進一步深化傳統(tǒng)課堂改革，促進學生綜合素質的提升。

腫瘤細胞的轉移播散是腫瘤發(fā)生發(fā)展中最具危險的過程。有效減少腫瘤細胞從原發(fā)灶轉移以及降低其本身的侵襲性是治療晚期癌癥的關鍵因素。上皮間質轉化（EMT）是一個由充分分化的上皮細胞轉化為間充質表型的過程，是導致腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵。臨床研究證明EMT 在鼻咽癌的侵襲、轉移過程中扮演重要的角色，是鼻咽癌不良預后的重要表征，隨著鼻咽癌惡性程度的增高，鼻咽癌細胞中上皮細胞標志物E-cadherin 蛋白表達水平降低，間質細胞標志物Vimentin蛋白等表達增加。蛋白質印跡法結果顯示：隨著AZD9291 劑量的升高，HNE1 和CNE2Z 細胞E-cadherin 蛋白上調，Vimentin蛋白下調。Transwell和劃痕實驗結果表明AZD9291 可以抑制HNE1 和CNE2Z細胞的遷移能力。

PI3K-AKT-mTOR通路做為EGFR的重要的下游信號通路之一，在細胞增殖、凋亡和代謝的過程中，起著重要的作用，在腫瘤細胞發(fā)生、侵襲和轉移中也同樣具有重要的作用。EGFR的酪氨酸磷酸化充當PI3K的停靠位點，然后刺激了磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸的生成并促進AKT的激活，通過激活PI3K-AKT-mTOR通路從而促進相關蛋白質的表達，進而促進細胞的增殖、侵襲和轉移。本實驗研究發(fā)現(xiàn)AZD9291 對HNE1和CNE2Z細胞的PI3K-AKT-mTOR信號通路有顯著影響，能夠顯著降低PI3K、AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平，隨著給藥濃度增加，PI3K-AKT-mTOR信號通路磷酸化水平降低，從而抑制鼻咽癌細胞增殖和遷移的作用。為進一步了解AZD9291抑制HNE1和CNE2Z細胞遷移的分子機制，接著我們開始驗證，PI3K-AKTmTOR通路與鼻咽癌細胞遷移的關系，我們發(fā)現(xiàn)給予AZD9291 和激活劑的細胞的遷移能力較僅給予AZD9291的細胞有所增強，以此證明了我們的猜測，PI3K-AKT-mTOR信號通路與HNE1和CNE2Z細胞的增殖和遷移有關。

綜上所述，本研究初步證實AZD9291能夠抑制鼻咽癌HNE1和CNE2Z細胞的增殖和遷移行為，其機制可能與抑制EGFR下游PI3K-AKT-mTOR信號從而發(fā)揮對下游E-cadherin和Vimentin蛋白的調控有關，為鼻咽癌的治療提供了新的思路及線索，為AZD9291用于鼻咽癌靶向治療提供了一種新的可能。