胃癌是全球常見消化道惡性腫瘤類型之一。由于幽門螺桿菌感染高發(fā)、飲食結(jié)構(gòu)不良等因素，我國年新發(fā)胃癌人數(shù)約40萬，給社會和家庭造成沉重負擔(dān)。近年來我國早期篩查和診治手段有廣泛應(yīng)用和顯著提高，早期胃癌患者5年生存率可達90%以上，但主要受限于早期癥狀不明顯造成多數(shù)患者初診即為中晚期，目前5年總體生存率僅為35.1%。因此，深入研究胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制以尋找新的治療靶標(biāo)對提高患者生存率就顯得尤為重要。由NR4A1基因編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Nur77是核受體超家族的重要成員之一，在多種細胞生命活動和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用，參與調(diào)節(jié)炎癥、自噬、腫瘤發(fā)生和進展等過程中。近年來已在乳腺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤等研究中分別發(fā)現(xiàn)Nur77充當(dāng)關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子或者活化促癌信號通路廣泛參與腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，但其在胃癌中的作用研究尚未見報道，本研究中首次聚焦于Nur77參與的免疫調(diào)節(jié)對胃癌惡性進展的影響。本研究將基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析Nur77在胃癌表達程度及其與患者預(yù)后之間聯(lián)系，并利用靶向處理研究Nur77對胃癌細胞遷移、侵襲能力的影響，以及探討胃癌細胞中Nur77發(fā)揮作用的相關(guān)分子機制。

此次用戶大會期間，COMSOL在電池領(lǐng)域的一位用戶代表就為大家分享了他們的一些應(yīng)用經(jīng)驗。據(jù)介紹，借助COMSOL多物理場仿真技術(shù)，該公司將仿真與試驗相結(jié)合，建立了鋰離子動力電池設(shè)計也性能關(guān)系模型，幫助工程師了解電池設(shè)計中的限制因素，研究電池內(nèi)部反應(yīng)機制，指導(dǎo)電池設(shè)計參數(shù)的優(yōu)化，實現(xiàn)了提高產(chǎn)品質(zhì)量、縮短研發(fā)周期、降低成本的多方面目標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及培養(yǎng) 人胃癌細胞系A(chǔ)GS、MKN-45以及人胃粘膜上皮細胞GES-1（上海中喬新舟生物科技），所有細胞均附有短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）鑒定檢驗報告；AGS細胞采用含10%胎牛血清（FBS）F12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基，MKN-45細胞為含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，GES-1細胞為10%FBS的高糖DMEM（D-葡萄糖濃度為4.5 g/L）培養(yǎng)，含終濃度為1%青霉素和鏈霉素，置恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、5%CO條件下培養(yǎng)和傳代。

歷史唯物主義認為，社會存在決定社會意識，社會意識對社會存在具有能動作用。社會意識由于受人類思維深度和廣度等因素影響，又具有相對獨立性。黨的群眾史觀作為一種社會意識，是由社會存在即當(dāng)時的歷史條件決定的，其產(chǎn)生發(fā)展有它深刻的歷史背景和理論淵源。而正是由于社會意識的相對獨立性，中國共產(chǎn)黨群眾史觀在不同歷史時期和階段有其精彩紛呈的外在表現(xiàn)。

1.1.2 主要耗材和試劑 細胞培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素混合液（Gibco；FBS（Biological Industries）；RIPA 裂解液、制膠液等免疫印跡實驗相關(guān)試劑，4%多聚甲醛（北京索萊寶公司）；高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測曝光液蛋白Marker、柱式總核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄以及實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）試劑盒（南京諾唯贊公司）；結(jié)晶紫溶液、一抗稀釋液（上海碧云天公司）；兔抗人Nur77、鼠抗人β-actin抗體（武漢三鷹公司）；兔抗人p65、p-p65、Stat3、p-Stat3抗體（CST）；兔抗人IL-6、HRP偶聯(lián)的抗鼠和抗兔二抗（南京川博公司）；人IL-6 ELISA檢測試劑盒（杭州聯(lián)科公司）；基質(zhì)膠Matrigel和Transwell小室（Corning）；Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher）；siRNA-Nur77（5'-TCGAGGACTTCCAGGT GTA-3'）、siRNA-IL-6（5'-CCCAGGAGAAGAUUCC AAATT-3'）以及陰性對照，IL-6引物由上海生工生物工程有限公司合成；Nur77過表達及對照空載質(zhì)粒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。

考慮到QoS參數(shù)包括QoS概念和QoS數(shù)值兩部分，因此QoS的綜合相似度是由QoS屬性概念的語義相似度和QoS屬性的數(shù)值相似度共同決定的。首先進行了兩個QoS參數(shù)的語義匹配，當(dāng)語義上存在可比性時，才進行下一步的數(shù)值處理和數(shù)值匹配。

1.2 方法

通過分析Oncomine數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移中關(guān)鍵促進因子IL-6與Nur77表達存在緊密聯(lián)系，其表達相關(guān)性R=0.490（圖2A）。使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫進一步驗證發(fā)現(xiàn)，Nur77（NR4A1基因）與IL-6之間呈正相關(guān)關(guān)系，R=0.384，（＜0.001，圖2B）。RT-PCR 結(jié)果顯示，siRNA-Nur77組MKN-45細胞中IL-6的mRNA表達水平較陰性對照組明顯升高，而外源性上調(diào)Nur77后IL-6可見大幅上升（＜0.001，圖2C）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，siRNA-Nur77組胃癌細胞中IL-6蛋白的表達水平較陰性對照組明顯下調(diào)，而siRNA-IL-6處理對胃癌細胞中Nur77表達無顯著影響（圖2D）。

1.2.4 ELISA 檢測Nur77 干擾處理前后IL-6 分泌量將胃癌細胞接種于6 孔板（2.5×10/孔），細胞分組同1.2.3處理24 h 后更換為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)處理24 h。收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明書提供的操作步驟檢測IL-6 的分泌量，每組實驗均獨立重復(fù)3 次。

1.2.6 Transwell實驗觀察Nur77和IL-6對胃癌細胞的侵襲能力影響 胃癌細胞分為4組：空載體組和過表達Nur77組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒處理24 h后siRNA-Negative control繼續(xù)處理24 h）；空載體轉(zhuǎn)染后干擾IL-6處理組，過表達Nur77 結(jié)合干擾IL-6 處理組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒處理24 h 后siRNA-IL-6繼續(xù)處理24 h）。按照1∶8的比例用基質(zhì)膠（4 ℃預(yù)融化）和RPMI 1640培養(yǎng)基混合后以50 μL體積每孔滴入Transwell小室中央，放置細胞培養(yǎng)箱中靜置2 h后，下室加入完全培養(yǎng)基，上室加入上述處理各組5×10細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后取出侵襲小室，吸凈上室培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min后清洗3次，棉簽輕輕擦凈上室，倒置顯微鏡下計數(shù)膜背面細胞數(shù)，200倍鏡下隨機計數(shù)5個視野取平均值，每組設(shè)重復(fù)孔3個。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測Nur77處理前后胃癌細胞的NFκB/IL-6信號通路 細胞用RIPA裂解后提取總蛋白，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜和0.5%脫脂奶粉封閉1 h后用一抗稀釋液稀釋相應(yīng)抗體4 ℃孵育過夜于次日洗膜后孵育對應(yīng)的二抗（稀釋比為1∶5000）室溫水平搖床繼續(xù)孵育1 h后洗凈后采用ECL化學(xué)發(fā)光自顯，利用軟件將目的條帶灰度數(shù)值化，并與β-actin的灰度值作歸一化處理后計算表達差異。

1.2.5 劃痕實驗觀察Nur77干擾后胃癌細胞的遷移能力 將胃癌細胞以2.5×10/孔接種于6孔板中，待細胞密度達60%時分為陰性對照組和siRNA-Nur77組進行處理，24 h后用10 μL移液槍頭垂直于6孔板劃痕，吸取PBS抵壁輕輕洗滌2次后加入無血清培養(yǎng)基，選取固定視野在倒置顯微鏡下對劃痕進行拍照記為0 h劃痕寬度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次拍照。計算各組劃痕愈合百分比=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.3 qRT-PCR檢測靶向調(diào)控Nur77表達后IL-6表達將對數(shù)生長期的MKN-45細胞接種于6孔板中，待細胞覆蓋率達60%左右將細胞分為4 組：陰性對照組（Negative control，轉(zhuǎn)染無序序列）、干擾組（轉(zhuǎn)染siRNA-Nur77）；空載體組（轉(zhuǎn)染空載體）、過表達組（轉(zhuǎn)染Overexpression Nur77）進行處理，待24 h后按說明書提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計在260/280 nm處檢測RNA純度。按照逆轉(zhuǎn)錄以及PCR試劑盒的操作步驟進行反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，40次循環(huán)反應(yīng)（95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s），融解曲線（95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s）。以β-actin為內(nèi)參，IL-6引物序列如下：上游序列，5'-GCCACTCACCTCTTCAGAACG-3'；下游序列，5'-TGCCTCTTTGCTGCTTTCA-3'，用2法計算IL-6表達變化，實驗重復(fù)3次后計算平均值。

對水功能區(qū)實行保護和監(jiān)督管理，應(yīng)當(dāng)根據(jù)其功能定位和分級分類要求，統(tǒng)籌水量、水質(zhì)、水生態(tài)，嚴(yán)格管理和控制涉水活動。但目前的水功能區(qū)劃成果僅有水質(zhì)管理目標(biāo)，缺乏水量和水生態(tài)的管理要求，距離水功能區(qū)水量、水質(zhì)、水生態(tài)統(tǒng)籌管理的要求有較大差距，需要進一步系統(tǒng)研究水功能區(qū)水量和水生態(tài)的保護目標(biāo)和管理要求，健全水功能區(qū)管理體系。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析

與圖2C、2D結(jié)果相一致的是，ELISA 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染上調(diào)Nur77的胃癌細胞培養(yǎng)基中IL-6 的分泌水平較空載質(zhì)粒組有明顯升高，而干擾Nur77可顯著抑制IL-6的表達（＜0.001，圖3A）。細胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，siRNA-Nur77組胃癌AGS、MKN-45細胞的劃痕在24 h 時劃痕較各自陰性對照組更明顯（圖3B）；AGS、MKN-45細胞各陰性對照組和siRNA-Nur77組平均劃痕愈合率相比為（65.54±4.63）%.（26.03±5.80）%，（68.63±1.56）%.（30.71±2.78）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.001）。Transwell 侵襲實驗顯示AGS和MKN-45細胞過表達Nur77組平均穿膜細胞數(shù)分別為414±12個、439±10個，相較空載組284±15和267±9個細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.001）。在空載組以及過表達Nur77胃癌細胞中siRNA-IL-6處理均可顯著下調(diào)侵襲細胞數(shù)（＜0.001；圖3C、D）。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并且通過方差齊性檢驗，兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），獨立樣本采用檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ檢驗，＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 胃癌組織及細胞中Nur77與IL-6表達之間調(diào)控關(guān)系

1.2.1 生物信息學(xué)驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫（https://www.oncomine.org/）獲取胃癌組織與正常胃組織中Nur77（基因名NR4A1）的研究數(shù)據(jù)，樣本含胃黏膜組織29例，胃混合腺癌8列，分析閾值設(shè)置如下：檢驗，=0.01，變化倍數(shù)為1.5 倍，基因等級為10%，類型為mRNA；基因轉(zhuǎn)錄表達相關(guān)性分析基于Ooi Gastric數(shù)據(jù)；在Human Protein Atlas 網(wǎng)站（https://www.proteinatlas.org/）中，基于免疫組化結(jié)果從蛋白表達水平觀察Nur77在胃癌組織與正常胃組織中的表達分布差異，所用抗體為HPA 070142；利用GEPIA2在線分析工具（http://gepia2.cancer-pku.cn/）分析Nur77與胃癌患者總生存期（OS）的相關(guān)性：依據(jù)胃癌患者Nur77表達值的中位數(shù)，分為高表達和低表達2組，計算風(fēng)險比和相應(yīng)P值并制作生存曲線；Nur77與IL-6表達相關(guān)性設(shè)置相關(guān)系數(shù)為Pearson。

2.3 Nur77促進胃癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移依賴IL-6表達

與正常胃黏膜組織相比，胃癌腫瘤組織中Nur77的mRNA表達較高（=0.001；圖1A）；免疫組化結(jié)果顯示，Nur77在正常胃組織中部分細胞中有散在分布，整體呈現(xiàn)低或弱表達水平，胃癌組織中腫瘤細胞高表達Nur77，特異性較好，在細胞核內(nèi)多可見Nur77陽性染色（圖1B）。GEPIA2數(shù)據(jù)庫在線分析結(jié)果中可見Nur77高表達組患者的生存率遠低于低表達組（＜0.05，圖1C）。與上述結(jié)果較為一致的是，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示胃癌AGS和MKN-45細胞中Nur77蛋白表達水平均要明顯高于胃黏膜上皮細胞GES-1（圖1D）。

2.4 Nur77表達改變對胃癌細胞NF-κB/IL-6信號通路活化的影響

免疫印跡結(jié)果顯示，在胃癌AGC 細胞中下調(diào)Nur77表達可顯著抑制p-p65、p65的表達（分別下降約69%和43%；＜0.001），同時可見NF-κB/IL-6活化下游標(biāo)記分子Stat3活化（磷酸化）的明顯下降以及Stat3分子表達受到顯著抑制（分別下降約72%和80%；＜0.001）；而與空載體組細胞相比，過表達Nur77則明顯上調(diào)了p-p65、p65、p-Stat3和Stat3蛋白的表達強度（分別上升約31%、122%、275%和57%；＜0.001）。胃癌MKN-45細胞分別在干擾和過表達Nur77后表現(xiàn)出與AGC細胞較為一致的上述蛋白表達變化趨勢。以上結(jié)果表明，胃癌細胞中Nur77可能參與NF-κB/IL-6信號通路活化調(diào)控。。

3 討論

最新基于生物信息學(xué)的研究認為，在多數(shù)腫瘤類型中Nur77處于廣泛低表達狀態(tài)，但是不同腫瘤甚至同種亞型間又存在較大的表達差異，這可能與其伴隨腫瘤進展不同時期發(fā)揮的特定功能有關(guān)。本研究首先整理Oncomine 網(wǎng)站數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Nur77 的mRNA表達強度要遠高于正常胃黏膜上皮組織；免疫組化和免疫印跡結(jié)果也表明，其作為核受體蛋白主要集中于細胞核中；與正常細胞相比，胃癌細胞中高表達Nur77蛋白。進一步在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中根據(jù)Nur77表達強度分為高、低組后，我們發(fā)現(xiàn)高表達Nur77組胃癌患者預(yù)后要遠差于低表達組。研究表明對于包括胃癌在內(nèi)的腫瘤患者而言，遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)無疑是造成不良預(yù)后的主要原因。目前關(guān)于Nur77在腫瘤細胞中作用尚存在較大爭議，例如在乳腺癌、肺癌和肝癌細胞中靶向干擾或者抑制Nur77表達和功能均可顯著降低TGF-β表達，下調(diào)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和侵襲能力；結(jié)腸癌研究中指出在缺乏TGF-β存在的情況下Nur77可參與泛素化降解分化抑制因子1（ID1）蛋白從而發(fā)揮抑癌作用，但在TGF-β作用下Nur77參與上調(diào)ID1表達從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移和奧沙利鉑抵抗形成；在缺氧情況下，Nur77直接結(jié)合到抑癌因子p63促進結(jié)腸癌EMT和轉(zhuǎn)移發(fā)生；而肝癌中低表達的Nur77則是腫瘤細胞糖酵解、增殖、轉(zhuǎn)移等一系列進程的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。本研究中我們分別通過siRNA下調(diào)和質(zhì)粒過載轉(zhuǎn)染處理，劃痕及Transwell實驗證實胃癌細胞中高表達的Nur77參與遷移和侵襲，提示Nur77高表達患者預(yù)后較差可能與較強的胃癌細胞惡性生物學(xué)行為有著潛在聯(lián)系。

式中SOC團儲為土壤團聚體有機碳儲量，t/hm2；SOC團為土壤團聚體的有機碳含量，g/kg；W團為團聚體質(zhì)量比例(W團=M團/M土；M團為團聚體質(zhì)量；M土為土壤質(zhì)量)；r為土壤容重，g/cm3；H為土壤厚度，cm。

研究表明，在消化道惡性腫瘤特別是胃癌發(fā)生過程中慢性炎癥充當(dāng)始動和促進因素，而NF-κB信號通路因廣泛參與細胞增殖、分化、基因組穩(wěn)定性以及免疫反應(yīng)等一系列過程中被認為在其中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。目前研究指出，當(dāng)胃部組織受到如幽門螺桿菌等微生物侵入以及后續(xù)組織損傷的刺激時，NF-κB信號會在在感染部位被高度激活以增強機體抗菌能力和維持組織功能穩(wěn)態(tài)，但持續(xù)感染造成的慢性炎癥則又可能導(dǎo)致組織進一步損傷，并通過例如形成細胞壓力和積累DNA損傷等造成遺傳穩(wěn)定性和表觀遺傳學(xué)修飾狀態(tài)的改變，最終形成致瘤微環(huán)境直至胃癌。在胃癌進展中NF-κB信號常處于異常和持續(xù)激活狀態(tài)，伴隨著促炎細胞因子表達增加，其中下游標(biāo)志性靶分子IL-6可在促進腫瘤血管新生、惡性增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，但是目前對于胃癌中NF-κB信號活化的具體分子基礎(chǔ)尚需進一步探究。本研究基于Oncomine和GEPIA2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，不同類型胃癌組織中Nur77與IL-6的mRNA表達之間均存在顯著正相關(guān)關(guān)系。由于在細胞中Nur77處于迅速降解并時刻受嚴(yán)格控制的狀態(tài)，眾多炎癥或者免疫調(diào)節(jié)相關(guān)研究指出其與IL-6之間多為負向調(diào)控，如帕金森細胞模型中下調(diào)Nur77后可見p65、IL-6的表達上調(diào)；而在Nur77敲除小鼠體內(nèi)包括IL-6在內(nèi)的多種促炎性因子出現(xiàn)顯著升高；免疫反應(yīng)中Nur77的表達穩(wěn)定會持續(xù)抑制IL-6的表達和分泌。與上述研究結(jié)果不同的是，我們通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，在胃癌細胞中下調(diào)Nur77處理可以有效抑制IL-6的表達，但siRNA-IL-6處理對Nur77 本身表達無顯著影響。進一步通過ELISA和Transwell實驗證實，胃癌中Nur77分子參與IL-6表達和分泌上調(diào)，而Nur77對胃癌細胞侵襲能力增強依賴于IL-6的合成。后續(xù)機制研究中也初步證實，Nur77過表達后p-p65和p65蛋白上調(diào)，同時IL-6作用后標(biāo)志性活化下游p-Stat3和Stat3均明顯增加，Nur77抑制的結(jié)果相反。這表明在胃癌遷移和侵襲過程中，Nur77可能通過活化NF-κB信號通路上調(diào)IL-6表達，從而增強胃癌細胞遷移和侵襲的能力。

綜上所述，本研究首次在胃癌中發(fā)現(xiàn)高表達Nur77，并初步揭示了胃癌中Nur77表達與患者不良預(yù)后存在聯(lián)系；Nur77可通過NF-κB/IL-6信號途徑參與胃癌細胞遷移、侵襲進程。圍繞Nur77對NF-κB信號通路活化調(diào)控的具體分子途徑，有待本課題組后續(xù)進一步探究。本研究為闡述Nur77在胃癌惡性進展中的作用及作用機制提供了研究基礎(chǔ)，并為胃癌的早期診斷、預(yù)后判斷或治療提供可能的新靶向位點。