吳浩源 梁 媛 梁 健

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西南寧市 530001； 2 廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西南寧市 530004)

胃癌系源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，近年來胃癌的發(fā)病率不斷下降，但其仍是全球第五大常見癌癥，同時(shí)死亡人數(shù)高居第4位[1-2]。研究表明，胃癌對(duì)放化療的敏感性不高，根治性手術(shù)切除仍是治愈胃癌的唯一手段，但在手術(shù)理念和技術(shù)顯著提高的今天，胃癌患者的預(yù)后仍未獲得顯著改善，患者的5年生存率僅為8%～34%，局部復(fù)發(fā)率高達(dá)40%～90%，即使接受術(shù)后輔助治療，患者的長(zhǎng)期生存率也無明顯提高[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建思想與中醫(yī)理論的“整體觀”相符合，可較為準(zhǔn)確地對(duì)中藥的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，也可對(duì)常見的中藥配伍方法進(jìn)行闡述和論證[4]。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，能夠治療胃部疾病屬熱證者。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，左金丸、黃連解毒湯對(duì)胃癌有一定的治療作用[5-6]，其主要成分包含黃連。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析黃連治療胃癌的潛在作用靶點(diǎn)及可能的分子機(jī)制，為今后胃癌的臨床治療和科學(xué)研究提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃連的有效化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)篩選 以完整拼音的形式在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://tcmspw.com/)檢索黃連，按照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出黃連所含的有效化學(xué)成分，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)有效化合物結(jié)構(gòu)等基本信息逐一核對(duì)驗(yàn)證，確保信息準(zhǔn)確無誤。通過TCMSP檢索有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ睾?，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換為官方基因名。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選 以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genecards.org/)，得到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 通過Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制黃連有效化學(xué)成分作用靶點(diǎn)及胃癌相關(guān)靶點(diǎn)基因的韋恩圖，所得到的交集基因即為黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)。針對(duì)黃連的有效化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)、黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)，通過CytoScape 3.8.2軟件構(gòu)建黃連有效化學(xué)成分-胃癌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)中，選擇“Multiple proteins”后導(dǎo)入黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)，并將蛋白種類參數(shù)設(shè)置為“人類”，由于圖形過于復(fù)雜，將置信度設(shè)為>0.9，得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 功能與通路富集分析 針對(duì)黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)，通過Metascape在線平臺(tái)(http://www.bio-review.com/metascape/)進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，并通過OmicShare網(wǎng)站(https://www.omicshare.com/)分別繪制氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 黃連的有效化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn) 通過檢索 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到中藥黃連所含有效化學(xué)成分14個(gè)(見表1)，作用靶點(diǎn)596個(gè)，匯總?cè)ブ睾蟮玫接行Щ衔镒饔冒悬c(diǎn)159個(gè)。

表1 黃連的有效化學(xué)成分

2.2 疾病靶點(diǎn)及黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)基因 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出胃癌的靶點(diǎn)基因835個(gè)，將其與黃連有效化學(xué)成分的159個(gè)作用靶點(diǎn)取交集，獲得86個(gè)交集靶點(diǎn)(見圖1)，即黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)，包括一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1,PRSS1)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS)1、PTGS2、視黃醇類Ⅹ受體α(retinoid Ⅹ receptor alpha,RXRA)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)等靶點(diǎn)。

圖1 黃連有效化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與胃癌相關(guān)靶點(diǎn)基因的韋恩圖

2.3 黃連有效化學(xué)成分-胃癌調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用CytoScape 3.8.2軟件構(gòu)建黃連有效化學(xué)成分-胃癌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共由98個(gè)節(jié)點(diǎn)、228條邊構(gòu)成，見圖2。

圖2 黃連有效化學(xué)成分-胃癌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò) 通過STRING構(gòu)建黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由86個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)和1 422條邊組成，連接的節(jié)點(diǎn)越多，表明該蛋白的核心地位越高，見圖3。

圖3 黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO功能富集分析結(jié)果顯示，黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)基因共涉及105個(gè)生物過程，主要為DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、激酶調(diào)控因子活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞核受體的活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)共涉及140條信號(hào)通路，包括白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號(hào)通路等。本文僅列出富集程度排前20的生物過程和信號(hào)通路，并繪制氣泡圖，見圖4、圖5。

圖4 GO富集分析—生物過程的氣泡圖

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，我們推測(cè)中藥黃連主要通過槲皮素、巴馬汀、表小檗堿、甲基黃連堿等有效化學(xué)成分，作用于NOS2、PRSS1、PTGS1、PTGS2、RXRA、AR、ESR1等靶點(diǎn)，從而發(fā)揮治療胃癌的作用。槲皮素有清熱解毒、提高免疫力、抗腫瘤的作用。已有研究表明，槲皮素、小檗堿能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡[7-8]。黃連堿是中藥黃連的特征性成分，具有抗微生物活性及保護(hù)胃黏膜、抗癌、改善免疫系統(tǒng)功能的作用。此外，既往研究也表明，相關(guān)作用靶點(diǎn)與胃癌及癌前病變都有著緊密的聯(lián)系。例如，慢性萎縮性胃炎屬于癌前病變，而調(diào)節(jié)NOS2的表達(dá)能夠治療慢性萎縮性胃炎，阻止癌前病變演變成胃癌[9]。敲低PRSS1的表達(dá)后,胃癌MGC803和BGC823細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，PRSS1能通過Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3途徑參與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[10]。AR在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，其參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展，且與腫瘤的大小呈正相關(guān)[11]。

我們進(jìn)一步進(jìn)行了功能和信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，黃連作用于胃癌的靶點(diǎn)涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)控因子活性等生物過程，以及IL-17、TNF、HIF-1等信號(hào)通路。幽門螺桿菌被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一級(jí)致癌物，其與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)控因子活性等生物過程貫穿于胃癌的發(fā)生和發(fā)展，以及幽門螺桿菌感染的過程中[12-13]。此外，有研究顯示，幽門螺桿菌感染后機(jī)體血清中IL-32、IL-1β、TNF-α水平顯著提高[14]，且胃癌患者血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平顯著升高[15]，這提示幽門螺桿菌感染機(jī)體后，可能通過IL、TNF等信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的發(fā)生。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/HIF-1α信號(hào)通路可治療胃癌前病變，從而預(yù)防胃癌的發(fā)生[16]。結(jié)合上述研究結(jié)果，我們推測(cè)，黃連的有效化學(xué)成分作用于相關(guān)靶點(diǎn)后，通過調(diào)控上述生物過程、信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療胃癌的作用，或者通過治療癌前病變預(yù)防胃癌發(fā)生。

綜上所述，黃連可能主要通過槲皮素、巴馬汀、表小檗堿、甲基黃連堿等有效成分作用于相關(guān)靶點(diǎn)，調(diào)控DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)控因子活性等生物過程，以及IL-17、TNF、HIF-1等信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療胃癌的作用。但本研究?jī)H基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行分析，未進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，今后將進(jìn)一步開展相關(guān)研究，更深入地闡明黃連治療胃癌的機(jī)制。