黃雪梅 匡雅琪 劉雨平 林媛媛 羅佐杰

(1 廣西南寧市第一人民醫(yī)院內分泌科，廣西南寧市 530022；2 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，廣西南寧市 530021)

腎上腺皮質癌(adrenocortical carcinoma，ACC)是內分泌系統(tǒng)的惡性腫瘤，起病隱匿、惡性程度高、侵襲性強。ACC早期確診率較低，大多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)局部或遠處轉移征象[1-2]，而發(fā)生腫瘤轉移的患者5年生存率不到15%[3]。手術切除原發(fā)腫瘤及轉移病灶是目前ACC的主要治療方法，但是手術治療不能防止腫瘤的復發(fā)和遠處轉移。對于不能根治性切除腫瘤或無法手術者，常采用化療、放療和分子免疫治療等輔助治療[4-5]。米托坦是美國食品藥品監(jiān)督管理局唯一批準使用的ACC治療藥物，但治療窗口窄，會出現(xiàn)神經(jīng)毒性、腎上腺皮質功能不全和急性肝功能受損等嚴重的不良反應，其安全性和有效性仍存在爭議[6-7]。而其他的化療、放療及免疫治療等輔助治療對ACC的治療效果比較局限[8]。姜黃素是從姜科植物根莖中提取的化合物，具有較強的抗腫瘤活性[9-11]。本課題組前期研究表明，姜黃素可以抑制ACC細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導ACC細胞凋亡，抑制SW-13細胞荷瘤裸鼠移植瘤的生長[12]。有學者發(fā)現(xiàn)姜黃素在發(fā)揮抗腫瘤作用時可導致miRNA表達譜發(fā)生改變[13-14]。然而，目前姜黃素干預ACC的miRNA調控機制尚不明確。因此，本研究通過高通量小RNA測序探討姜黃素干預ACC SW-13細胞的miRNA調控機制。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 姜黃素購于美國Sigma公司(批號：458-37-7)，NucleoZOL試劑盒購自德國MN公司(批號：740404)，miRNA 第一鏈 cDNA 合成試劑盒購自上海生工生物工程公司(批號：B532451)，SYBR Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司(批號：RR820A)。NanoDrop 2000c微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Agilent 2100生物分析儀購自美國Agilent Technologies公司。

1.2 細胞來源、培養(yǎng)和干預方法 人ACC SW-13細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，使用含有10%胎牛血清的高糖PMEM培養(yǎng)。將細胞接種在6孔板(5×105個/孔)中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日細胞貼壁、細胞密度達80%時進行后續(xù)實驗。將細胞分為對照組和姜黃素干預組，在對照組、姜黃素干預組細胞中分別加入基礎培養(yǎng)基2 mL、50 μmol/L姜黃素溶液2 mL，放置在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用NucleoZOL試劑盒提取兩組細胞的總RNA，分別經(jīng)NanoDrop 2000c微量分光光度計、Agilent 2100生物分析儀檢測RNA純度、完整性，將合格的總RNA用于文庫構建和測序。實驗重復3次。

1.3 小RNA文庫構建、測序和數(shù)據(jù)分析 小RNA文庫構建和測序分析均由上海生工生物工程公司完成。其中，采用NEXTseq 550測序儀(測序模式為SE75)進行測序；通過FastQC軟件對用于測序的原始序列數(shù)據(jù)進行質量評估，使用Cutadap去除接頭，Trimmomatic去除兩端質量堿基和序列過濾；使用BLASTN進行序列與Rfam數(shù)據(jù)庫的比對，以過濾掉樣本中的 sRNA、tRNA、snoRNA、snRNA；使用Bowtie分別進行序列與人物種的外顯子和內含子、參考基因組序列的對比、過濾，最后獲得純凈序列。

1.4 miRNA的注釋和新miRNA的預測 將獲得的純凈序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)中收錄的人物種已知miRNA序列和miRNA前體序列進行比對，得到序列的miRNA家族信息。使用miRDeep2軟件，將在Repbase數(shù)據(jù)庫(https://www.girinst.org/repbase/)過濾比對后剩余的序列與參考基因組序列進行比對后，進行miRNA的表達定量和二級結構分析，預測新的miRNA。

1.5 miRNA的差異性表達分析、功能和通路富集分析 使用edgeR軟件對已知miRNA和新預測的miRNA進行差異性表達分析，采用RPM(reads per million mapped reads)將數(shù)據(jù)歸一化處理，以P<0.05、|log2FC|>1作為標準，篩選出差異性表達的miRNA。在miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)數(shù)據(jù)庫中，對差異性表達的miRNA進行靶基因預測。采用clusterProfiler軟件對獲得的miRNA靶基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號通路富集分析。

1.6 實時熒光定量PCR驗證 采用實時熒光定量PCR對部分差異性表達的miRNA進行驗證。所選miRNA的引物序列由上海生工生物工程公司合成，見表1。采用NucleoZOL試劑盒提取對照組和姜黃素干預組干預24 h后SW-13細胞的總RNA，檢測 RNA 純度、完整性后，采用miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，反轉錄反應條件為：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，于4 ℃保存。采用SYBR Green? Premix Ex TaqTMⅡ進行定量檢測。反應體系共20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、cDNA 2 μL，RNase free H2O 6 μL。反應條件為：預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，熔解曲線95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以U6作為內參(由上海生工生物工程公司提供)，采用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量，實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用(x±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 姜黃素干預組和對照組miRNA的長度分布 對測序結果進行去除冗余接頭、不相關、低質量序列的處理后，獲得純凈序列。miRNA 長度為21～24 nt，在從對照組和姜黃素干預組細胞獲得的序列中，長度為21～24 nt的序列占比分別為77.68%和80.67%。見圖1。

圖1 姜黃素干預組和對照組miRNA的長度分布

2.2 miRNA的鑒定與差異性表達分析結果 對獲得的miRNA進行差異性表達分析，篩選出44個差異性表達的miRNA，其中21個miRNA在姜黃素干預后表達上調，23個miRNA表達下調。見圖2。

圖2 差異性表達miRNA 的火山圖

2.3 miRNA靶基因的功能富集分析 預測有靶基因且有功能的miRNA共9個，見表2。GO功能分析結果顯示，靶基因富集的生物學過程有21個，主要富集于細胞增殖、細胞遷移、細胞分化和凋亡等生物學過程；靶基因富集的細胞成分有11個，主要為細胞質、細胞核和細胞膜等細胞成分；靶基因富集的分子功能有17個，主要參與DNA結合、RNA結合、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)結合作用和催化作用等分子功能，見表3。在GO注釋分類的基礎上進行KEGG信號通路富集分析，結果顯示靶基因主要富集在癌癥途徑、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、內質網(wǎng)應激信號通路、細胞周期和凋亡途徑等19條信號通路，見表4。

表2 具有功能的差異性表達miRNA

表3 miRNA靶基因顯著富集的12個GO條目

表4 miRNA靶基因顯著富集的前5個KEGG條目

2.4 實時熒光定量PCR驗證結果 為了進一步驗證miRNA測序所獲得的結果，隨機選取6個miRNA(miR-184、miR-490-3p、miR-766-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-3622a-5p)采用加尾法熒光定量的方法檢測其相對表達量。結果顯示，miRNA的相對表達量與小RNA測序數(shù)據(jù)結果基本一致。見圖3。

圖3 差異性表達miRNA的實時熒光定量PCR驗證結果

3 討 論

miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，可以通過與靶基因mRNA堿基配對實現(xiàn)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯表達，調控靶基因的表達[15-16]。小RNA測序不僅可以鑒定保守的miRNA和預測新的miRNA，還能分析miRNA的表達特征[17]。本研究采用高通量小RNA測序分析姜黃素作用SW-13細胞時的miRNA調控機制，篩選出44個顯著差異性表達的miRNA，其中21個miRNA在姜黃素干預后表達上調，23個miRNA表達下調，共有9個差異性表達的miRNA有靶基因且有功能；采用實時熒光定量PCR對其中6個miRNA進行驗證，結果顯示這些miRNA的相對表達量與小RNA測序分析結果趨勢基本一致。miRNA作為致癌因子或腫瘤抑制因子，可成為腫瘤診斷、預后和評估治療效果的生物學標志物[18-19]。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p在胃癌組織和胃癌BGC-823細胞中呈低表達，miR-122-5p過表達可以抑制BGC-823細胞的遷移和侵襲性。miRNA可以靶向相關基因調控細胞的增殖、遷移和侵襲，例如miR-214-3p可以通過靶向調控Twist家族bHLH轉錄因子1來抑制子宮內膜癌細胞向上皮-間充質轉化和轉移[21]；Zou等[22]亦發(fā)現(xiàn)miR-192-5p通過靶向作用含三聯(lián)基元44以抑制肺癌的增殖、遷移和侵襲。本研究的小RNA測序分析結果顯示，經(jīng)姜黃素干預后，SW-13細胞中miR-122-5p、miR-184、miR-214-3p、miR-490-3p、miR-200c-3p、miR-3187-5p、miR-3622a-5p和miR-766-3p表達上調，miR-192-5p表達下調，這些差異性表達的功能miRNA將為姜黃素的抗ACC作用機制研究奠定更多的理論基礎。

GO是國際標準化的基因功能分類體系，其可全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO功能富集分析包括3個本體，分別為描述基因的分子功能、細胞成分和生物學過程。本研究中，GO功能富集分析結果顯示，姜黃素干預SW-13細胞后，差異性表達miRNA的靶基因主要富集在細胞增殖、細胞遷移、細胞分化和凋亡等生物學過程。有研究顯示，姜黃素可以通過miRNA 的特異性靶向作用抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[23-24]；Gallardo等[25]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過調控miR-34a的表達來抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。由此可見，姜黃素也可能通過調控上述miRNA來抑制細胞增殖、遷移、分化和凋亡，從而發(fā)揮抗ACC的作用。本研究KEGG信號通路富集分析結果顯示，姜黃素干預SW-13細胞后，差異性表達miRNA的靶基因顯著富集在癌癥途徑、MAPK信號通路、內質網(wǎng)應激信號通路、細胞周期和凋亡通路等。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過調節(jié)miR-21以調控磷酸酶張力蛋白同系物/磷脂?；?-激酶/蛋白激酶B通路，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。本課題組的前期研究顯示，姜黃素可以誘導ACC細胞凋亡，抑制腎上腺皮質癌SW-13裸鼠移植瘤的生長[12]。由此推測，姜黃素可能通過相關miRNA調控上述信號通路，從而發(fā)揮抗ACC的作用。

綜上所述，姜黃素可能通過miR-184、miR-490-3p、miR-766-3p、miR-200c-3p、miR-3622a-5p等miRNA參與調控癌癥途徑、MAPK信號通路、內質網(wǎng)應激信號通路、細胞周期和凋亡途徑等信號通路，以抑制細胞增殖、遷移、分化和凋亡，從而發(fā)揮抗ACC的作用，這或可為姜黃素治療ACC提供理論依據(jù)。