朱栗瓊，蒙東萍，招禮軍

(廣西大學(xué) 林學(xué)院, 廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南寧 530004)

自然界中種子植物個(gè)體和種群數(shù)量的增多及種質(zhì)基因的延續(xù)主要靠其成功的有性生殖來實(shí)現(xiàn)，若生殖過程中有任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都將不同程度地導(dǎo)致生殖失敗，因此了解植物的有性生殖、特別是植物大、小孢子的發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育規(guī)律具有重要意義，并可以根據(jù)其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)理，人為采取合理的措施控制其生長(zhǎng)發(fā)育過程，達(dá)到生產(chǎn)上的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)目的[1-2]。

羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)屬于羅漢松科(Podocarpaceae)羅漢松屬(Podocarpus)植物，主要分布在中國(guó)南部各省。羅漢松為常綠喬木，樹型優(yōu)美，枝干耐盤扎，對(duì)干旱、瘠薄環(huán)境有較強(qiáng)適應(yīng)性，具有良好的觀賞效應(yīng)和改善環(huán)境的作用。羅漢松內(nèi)含的酯類化合物[3]、雙黃酮化合物等藥用成分被挖掘[4]，已被證實(shí)具有一定醫(yī)療價(jià)值，羅漢松的盆景制作與賞析[5]、生理特征[6]、形態(tài)結(jié)構(gòu)[7-8]、遺傳多樣性[9]、培育方法[10]及其根瘤特性[11-12]等方面也有相關(guān)報(bào)道，而關(guān)于其生殖生物學(xué)的報(bào)道資料較少。本研究在羅漢松雄球花的分化和發(fā)育過程中，分階段取樣制片，通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，以期掌握羅漢松小孢子的發(fā)生和雄配子體的發(fā)育規(guī)律，為羅漢松的生殖和雜交組合提供胚胎學(xué)證據(jù)，并為其選育工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣地概況

羅漢松樣地位于南寧市廣西大學(xué)校園內(nèi)，位于107°45′～108°51′E，22°13′～23°32′N，地貌為典型低山、丘陵，平均海拔76.5 m，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，陽光充足，霜少無雪；年平均氣溫21.7 ℃，冬季1月最冷，均溫12.8 ℃，夏季7、8月最熱，均溫28.2 ℃；年平均降雨量1 298 mm，干濕季較明顯，夏季為雨季，秋冬季偏干旱[13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 開花物候觀察通過查詢和觀察了解到羅漢松花芽通常在10月中下旬開始分化，本實(shí)驗(yàn)2018年10月10日開始，選擇5株長(zhǎng)勢(shì)良好、樹體健壯的成熟羅漢松雄株樣樹，于樹干中部向陽面的位置選取5～10根枝條，每枝條上標(biāo)記10～20個(gè)花芽，研究羅漢松雄株群體從花芽分化至散粉的生長(zhǎng)發(fā)育情況，每7 d觀察和采集5個(gè)雄球花一次(休眠期除外)，并進(jìn)行拍照記錄，樣本置于FAA液保存。

1.2.2 花粉形態(tài)電鏡掃描參照羅敏蓉等[14]的方法，于盛花期隨機(jī)選擇樣樹正?；ㄐ?0枝，置于牛皮紙袋中將花粉抖落并裝入2 mL離心管密封，4 ℃冰箱保存。制片時(shí)通過2.5%戊二醛固定-磷酸緩沖液清洗3次-乙醇逐級(jí)脫水-干燥儀干燥-粘片-觀察-拍攝(Hitachi SU8220電子掃描顯微鏡)，隨機(jī)選擇花粉粒各角度20個(gè)界面拍攝，觀察和計(jì)算各特征值，取其平均值為數(shù)量特征值。

1.2.3 石蠟切片制片方法參照趙鉛等[15]的方法(適當(dāng)改進(jìn))對(duì)采集的羅漢松雄球花制片，具體步驟為：經(jīng)過乙醇逐級(jí)脫水-TO型生物制片透明劑透明-透蠟(54～56 ℃熔點(diǎn))-包埋-切片(6～8 μm)-烘片-乙醇逐級(jí)脫蠟-復(fù)水-染色(0.05%甲苯胺藍(lán))-封片(中性樹膠)等，用于制片的花序每階段樣本至少10枝，隨機(jī)切片30張。通光學(xué)顯微鏡對(duì)上述固定片進(jìn)行觀察和拍攝，重點(diǎn)觀察的內(nèi)容有：小孢子囊壁的發(fā)育、小孢子的發(fā)生、雄配子的發(fā)育等。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢松雄球花生殖物候及外形特征

經(jīng)觀察，羅漢松雄球花均為腋生。每年的9月花芽分化已基本完成，至10月圓錐狀單生雄球花出現(xiàn)，外有2層苞片包被，后持續(xù)發(fā)育成卵圓形，苞片由淺綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽攸S色(圖1，A)，球花頂端逐漸出現(xiàn)凹痕，至11月中下旬，凹痕加深并將花芽一分為二或三個(gè)(圖1，B)，形成簇生花序，持續(xù)生長(zhǎng)至12月中旬，花序體積有所增大，顏色進(jìn)一步加深(圖1，C)。12月下旬至次年2月，雄球花生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)入相對(duì)停止時(shí)期，外形、顏色、大小無明顯變化；進(jìn)入3月，雄球花快速生長(zhǎng)，首先是淺綠色球花撐裂苞片(圖1，D)，穗狀球花上螺旋狀著生小孢子葉球(圖1，E)，隨著時(shí)間的推移。小孢子葉球顏色依次轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色、黃色，花序軸及小孢子葉的迅速生長(zhǎng)，使得雄球花的體積也明顯增大。羅漢松雄球花初始散粉發(fā)生于3月中旬，4-5月中旬為群體雄球花的盛花期(圖1，F(xiàn))，至5月下旬或六月初所有雄球花基本枯萎變?yōu)楹稚€能在枝條上續(xù)存較長(zhǎng)時(shí)間。

2.2 羅漢松小孢子葉的發(fā)育

圓柱形的羅漢松雄球花上螺旋狀著生有許多小孢子葉(圖2，A)，小孢子葉的遠(yuǎn)軸面基部并列著生2個(gè)小孢子囊，即花粉囊，初生的小孢子囊由表皮和孢原細(xì)胞組成。

2.2.1 小孢子囊壁的發(fā)育小孢子葉分化形成初期，由其外側(cè)近中軸的基部孢原細(xì)胞快速分裂，形成的新細(xì)胞向內(nèi)分化為造孢細(xì)胞，向外分化為初生壁，后者進(jìn)一步分化成3層形態(tài)上有明顯差異的細(xì)胞，由外及里分別是藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層，各層均只有1層細(xì)胞，加上最外層的表皮細(xì)胞，小孢子囊壁發(fā)育成有4層細(xì)胞組成的結(jié)構(gòu)(圖2，B)。其中表皮細(xì)胞在生長(zhǎng)初期頂端與基部的細(xì)胞差異較明顯，縱切面上看，頂部細(xì)胞近長(zhǎng)方形，越近基部的表皮細(xì)胞與內(nèi)部的孢原細(xì)胞形態(tài)越相似，近方形，但均排列較整齊而緊密，具有明顯的液泡和細(xì)胞核。隨著內(nèi)部造孢細(xì)胞的形成，表皮的主要輪廓逐漸顯現(xiàn)，細(xì)胞體積增大，液泡化更明顯，至單核小孢子時(shí)期，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)至體積最大，各細(xì)胞形狀也呈現(xiàn)差異，同時(shí)外壁出現(xiàn)角質(zhì)層，直至花粉粒發(fā)育成熟時(shí)，小孢子囊的表皮細(xì)胞壁角質(zhì)化達(dá)到最厚(圖2，B中B1所示)。

藥室內(nèi)壁位于表皮之下，由孢原細(xì)胞分化形成。藥室內(nèi)壁由一層薄壁細(xì)胞組成，橫切面上呈長(zhǎng)方形，比表皮細(xì)胞體積大，但細(xì)胞質(zhì)顏色更深，內(nèi)含物豐富，細(xì)胞核占比更大。當(dāng)小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂期和單核小孢子發(fā)育初期時(shí)，藥室內(nèi)壁細(xì)胞變化明顯，細(xì)胞徑向伸長(zhǎng)迅速，外形上更扁平，內(nèi)含物增多，顏色進(jìn)一步加深，細(xì)胞壁上出現(xiàn)帶狀纖維加厚，此時(shí)的藥室內(nèi)壁亦可稱為纖維層。當(dāng)花粉發(fā)育成熟時(shí)，纖維層細(xì)胞徑向擴(kuò)展達(dá)到最大，細(xì)胞內(nèi)含物幾乎消失殆盡，細(xì)胞核也隨之解體成為死細(xì)胞。中層在纖維層之內(nèi)，主要出現(xiàn)在孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，在小孢子囊壁中呈扁平狀，細(xì)胞體積最小，細(xì)胞質(zhì)濃，細(xì)胞核大，內(nèi)含物豐富，中層存在的時(shí)間較短，當(dāng)減數(shù)分裂結(jié)束時(shí)，中層細(xì)胞的原生質(zhì)體會(huì)逐漸減少，形態(tài)變得更小且不規(guī)則，在花粉發(fā)育成熟前被分解吸收。絨氈層居于小孢子囊壁最內(nèi)層，細(xì)胞體積較中層細(xì)胞偏大，細(xì)胞質(zhì)濃，發(fā)育初期細(xì)胞核逐漸由單個(gè)變?yōu)槎鄠€(gè)，整齊地排列在中層細(xì)胞內(nèi)側(cè)，至單核小孢子時(shí)期，絨氈層細(xì)胞體積已達(dá)最大，隨之細(xì)胞質(zhì)發(fā)生濃縮，顏色加深，當(dāng)花粉發(fā)育成熟初期，絨氈層細(xì)胞體積變小，顏色變淺，慢慢降解，最終被吸收消失(圖2，B中B2所示)。因此，羅漢松小孢子囊壁的結(jié)構(gòu)從最初的一層表皮細(xì)胞發(fā)育成四部分組成，當(dāng)花粉粒發(fā)育成熟時(shí)又僅剩兩部分，即表皮和纖維層。散粉前，纖維層細(xì)胞因干燥收縮使小孢子囊壁撕裂，花粉粒得以散發(fā)出來。

2.2.2 小孢子的發(fā)生與發(fā)育小孢子囊形成初期是由一層表皮細(xì)胞包裹著若干個(gè)孢原細(xì)胞組成，然后由孢原細(xì)胞平周分裂進(jìn)一步產(chǎn)生孢子囊壁細(xì)胞和造孢細(xì)胞。造孢細(xì)胞初期為不規(guī)則多邊形，排列緊密，胞間連絲明顯，細(xì)胞質(zhì)顏色濃，細(xì)胞核大，并可見多個(gè)核仁。隨著進(jìn)一步的分裂，細(xì)胞數(shù)量增多，體積也增大，細(xì)胞逐漸變成近圓形，胞間隙變大，同時(shí)細(xì)胞壁出現(xiàn)胼胝質(zhì)，造孢細(xì)胞進(jìn)入小孢子母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期(圖2，C)。進(jìn)入減數(shù)分裂期時(shí)，同一個(gè)小孢子囊中可看到處于不同分裂時(shí)期的小孢子母細(xì)胞(圖2，D)，即羅漢松小孢子母細(xì)胞發(fā)育出現(xiàn)不等同性。

減數(shù)分裂的第一次分裂末期兩個(gè)核分別移向兩級(jí)，形成二分體(圖2，E)，隨后兩核各分裂一次形成四分體，四分體有四面體型和十字交叉型兩種排列方式，后者數(shù)量比例上占多數(shù)(圖2，F(xiàn))。四分體形成后，細(xì)胞表面的胼胝質(zhì)逐漸溶解消失，四分體相互分離形成單核小孢子，此時(shí)的單核小孢子細(xì)胞質(zhì)濃，具有2層細(xì)胞壁，外壁上有網(wǎng)狀花紋，并由外壁逐漸延伸形成2個(gè)對(duì)稱的氣囊，氣囊上也具有網(wǎng)狀花紋(圖2，G)，氣囊的發(fā)生開始于四分體時(shí)期。

2.3 羅漢松雄配子體的發(fā)育

雄配子體的第一個(gè)細(xì)胞就是單核小孢子。單核小孢子的進(jìn)一步發(fā)育首先表現(xiàn)在細(xì)胞中逐漸形成一個(gè)大液泡，將細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核擠壓至細(xì)胞壁邊緣，隨后細(xì)胞核發(fā)生第一次分裂，形成第一原葉細(xì)胞和胚性細(xì)胞，前者近圓形，較大，居于花粉粒中央，后者處于花粉粒近極面，形如一輪彎月。后胚性細(xì)胞發(fā)生分裂形成第二原葉細(xì)胞和精子器原始細(xì)胞，前者位于花粉粒近極面，靠近第一原葉細(xì)胞，形態(tài)和大小與第一原葉細(xì)胞相似，后者居于花粉粒中央，與胚性細(xì)胞形態(tài)相似。精子器細(xì)胞經(jīng)過短暫生長(zhǎng)后分裂形成1個(gè)生殖細(xì)胞和1個(gè)粉管細(xì)胞，后者居于細(xì)胞遠(yuǎn)極面。至此，雄配子體發(fā)育成熟(花粉粒)(圖2，H)，2個(gè)原葉細(xì)胞在生殖細(xì)胞形成時(shí)先后逐漸被吸收，有的甚至消失，因此成熟雄配子體大部分最后只有生殖細(xì)胞和管細(xì)胞(圖2，I)，屬于二細(xì)胞花粉粒。

2.4 成熟花粉粒微形態(tài)特征

掃描電鏡顯示，羅漢松花粉與松屬植物的花粉相似，花粉粒由本體和兩個(gè)氣囊組成(圖3，A)。近極面和遠(yuǎn)極面觀察均為橢球狀，側(cè)面看形似一頂帶耳的帽子(圖3，B)，兩個(gè)氣囊位于本體對(duì)稱的兩側(cè)，展開的角度較大，和本體連接處較薄，向遠(yuǎn)端逐漸加厚，表面均有不規(guī)則的波浪狀褶皺，近極面和遠(yuǎn)極面觀察氣囊均呈耳形，而側(cè)面看呈耳垂形，表面密集穴狀雕紋。經(jīng)測(cè)量，羅漢松花粉粒平均長(zhǎng)為40.502 μm，花粉粒本體平均長(zhǎng)21.965 μm，厚15.389 μm，兩者之比約為0.7，呈闊橢球狀，本體近極面的“帽”外壁加厚，表面有顆粒狀和條紋紋理，排列不規(guī)則，側(cè)面能看到“帽緣”上具密集瘤狀結(jié)構(gòu)，本體遠(yuǎn)極面中部具一較深的萌發(fā)溝，溝的表面粗糙不平，具顆粒狀和網(wǎng)狀紋理，溝的周圍還有瘤狀突起(圖3，C)。

3 討 論

繁殖是植物的重要生命現(xiàn)象之一，是實(shí)現(xiàn)物種的延續(xù)、擴(kuò)大及進(jìn)化的基礎(chǔ)。有性生殖作為最高級(jí)的繁殖方式，其中配子體的發(fā)生和發(fā)育過程中每一環(huán)節(jié)對(duì)植物有性生殖的順利進(jìn)行均至關(guān)重要[16]。松杉植物的花粉根據(jù)其內(nèi)部所存在的細(xì)胞數(shù)量一般分為3種類型：三細(xì)胞的銀杉型，代表植物是銀杉；四細(xì)胞的松型，包括松科和羅漢松科的絕大多數(shù)植物；五細(xì)胞的油杉型，如雪松屬、冷杉屬、落葉松屬、云杉屬、油杉屬等歸于此類[17]。實(shí)際上羅漢松成熟花粉粒中只有少部分含有2個(gè)退化的原葉細(xì)胞，介于2細(xì)胞和4細(xì)胞間，偏向2細(xì)胞型，紅豆杉科和三尖杉科植物與羅漢松科植物親緣較近，它們的花粉屬于二細(xì)胞型，無原葉細(xì)胞，因此將羅漢松花粉類型歸為二細(xì)胞型更合理。

總體來看羅漢松雄配子體的發(fā)育過程較順利，如下特性為其起到保駕護(hù)航的作用：

(1)小孢子囊的起源方式對(duì)小孢子的保護(hù)作用。羅漢松小孢子囊從一開始分化就同時(shí)具有表皮細(xì)胞和孢原細(xì)胞，前者包被于后者之外，對(duì)幼嫩組織營(yíng)造了一個(gè)穩(wěn)定的環(huán)境，有利于小孢子母細(xì)胞及后續(xù)發(fā)展。這種發(fā)育方式與大部分的裸子植物相似，如水松等[16]，少部分裸子植物的孢原細(xì)胞分化時(shí)無表皮細(xì)胞的保護(hù)，裸露于小孢子葉基部，如花旗松[17]。

(2)減數(shù)分裂的時(shí)機(jī)有利于確保其正常進(jìn)行。減數(shù)分裂是植物有性生殖的最進(jìn)化的方式，不僅保障了子代與父母本的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了子代的遺傳變異，使后代的適應(yīng)能力增強(qiáng)。有性生殖過程中母細(xì)胞的減數(shù)分裂對(duì)環(huán)境的變化特別敏感，如溫度、水分、光照、營(yíng)養(yǎng)等的異常均能影響減數(shù)分裂的正常進(jìn)行，從而影響植物的結(jié)實(shí)產(chǎn)量和質(zhì)量。羅漢松以造孢細(xì)胞發(fā)育后期的狀態(tài)進(jìn)入休眠，因此小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂發(fā)生在溫暖濕潤(rùn)的春季，避開了干旱而低溫的冬季，為其發(fā)育創(chuàng)造了良好的外界環(huán)境條件。裸子植物減數(shù)分裂的時(shí)機(jī)因種而異，如紅豆杉屬[17]植物多數(shù)情況下小孢子母細(xì)胞在休眠前已完成減數(shù)分裂，并發(fā)育成配子體；歐洲赤松、白云杉等[17]與羅漢松相似，小孢子母細(xì)胞在冬季休眠，春季解除休眠后進(jìn)行減數(shù)分裂。母細(xì)胞與子細(xì)胞相比較而言抗性強(qiáng)，同時(shí)在發(fā)育時(shí)間足夠的前提下母細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積蓄有利于提高子細(xì)胞的生活力，因此休眠后再進(jìn)行減數(shù)分裂的方式不免為一種進(jìn)化方式。

(3)花粉粒發(fā)育時(shí)間的不等同性可保障授粉的成功率。在減數(shù)分裂時(shí)期可在同一個(gè)小孢子囊中看到處于不同分裂時(shí)期的小孢子母細(xì)胞，可知羅漢松花粉粒的成熟步調(diào)不一致。此現(xiàn)象可能與發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給或者光照、溫度、水分等外部條件有關(guān)[18-19]，不過可延長(zhǎng)傳粉時(shí)間，增加授粉的成功率，可認(rèn)為是植物適應(yīng)環(huán)境的一種進(jìn)化表現(xiàn)[20-21]。從實(shí)際觀察到結(jié)實(shí)率較高的現(xiàn)象來推斷，羅漢松的花粉粒發(fā)育成功率較高，保障了授粉所需數(shù)量和質(zhì)量。生產(chǎn)上若需配子體發(fā)育實(shí)現(xiàn)同步性，可采用輔助授粉、改良培育技術(shù)或使用激素處理等方式實(shí)現(xiàn)，只要保證授粉的完全性，亦可達(dá)到提高種子的產(chǎn)量與質(zhì)量的目的[22-23]。觀察中發(fā)現(xiàn)羅漢松極少數(shù)小孢子囊的內(nèi)部有時(shí)會(huì)形成空腔，估計(jì)是小孢子數(shù)量多，營(yíng)養(yǎng)的有限性促使某些小孢子母細(xì)胞降解為換取其他小孢子的正常發(fā)育[24]，符合優(yōu)勝劣汰的生存原則。

羅漢松屬有不少優(yōu)良的盆景素材，如珍珠羅漢松、小葉羅漢松、貴妃羅漢松等都是盆景中的佼佼者，但以羅漢松的適應(yīng)性較為突出，高大的外形使其在大型景觀樹中獨(dú)具優(yōu)勢(shì)，因此可以把羅漢松作為優(yōu)良的雜交母本，將其獨(dú)特的基因引入同屬植物，以獲取觀賞性和抗逆性更強(qiáng)的新品種。