趙子賢，劉 立，謝 天，閻俊卉，文錦芬

(昆明理工大學(xué) 建筑與城市規(guī)劃學(xué)院，昆明 650500)

無(wú)論是低等植物還是高等植物其表面都覆蓋有蠟質(zhì)[1]，植物表皮蠟質(zhì)層的存在，在保持組織和器官功能、保證植物正常發(fā)育等方面起了重要的作用，在抵御各種環(huán)境脅迫如非生物脅迫強(qiáng)光、紫外線輻射、低溫和干旱[2-4], 生物脅迫如細(xì)菌和真菌病害以及昆蟲(chóng)等[2,5]蠟質(zhì)也具有重要的意義。植物表皮蠟質(zhì)的組成成分復(fù)雜多樣，目前發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)有100多種，其碳鏈長(zhǎng)度多在20～34個(gè)碳原子之間，主要由超長(zhǎng)飽和脂肪酸鏈(very long chain fatty acids，VLCFAs)及其衍生物組成[6-7]。

在蠟質(zhì)的生物合成過(guò)程中，脂肪酸延伸酶復(fù)合體FAE由 4 種酶構(gòu)成，其中β-酮脂酰輔酶A合成酶(KCS)是限速酶，具有嚴(yán)格的底物特異性，VLCFA 鏈的長(zhǎng)度由KCS決定[8]。目前在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了21個(gè)KCS基因，根據(jù)它們氨基酸序列的相似性，分為4個(gè)亞族：FAE1-like、KCS1-like、FDH-like和CER6；其中KCS2/DAISY 和KCS20參與C20到C22 VLCFAs的延伸、KCS9參與C22到C24 VLCFAs的延伸，而 KCS1 和CUT1/CER6/KCS6則參與C24 VLCFAs的進(jìn)一步延伸[9]。

百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)屬于百合科百合屬，作為一種重要的花卉，是世界公認(rèn)的五大切花之一，在中國(guó)切花種植中百合的種植面積僅次于玫瑰[10]。切花百合在采后和運(yùn)輸過(guò)程中由于失水導(dǎo)致花朵畸形和花早衰，影響花的品質(zhì)，降低其商品價(jià)值。花蕾表皮蠟質(zhì)對(duì)花的耐失水脅迫能力有重要的意義，研究切花百合蠟質(zhì)及代謝機(jī)理，對(duì)切花百合育種、生產(chǎn)和銷售均具有重要的實(shí)踐意義。

雖然在擬南芥、水稻、小麥、臍橙和苜蓿等植物中對(duì)KCS進(jìn)行了研究，但在觀賞園藝特別是百合中的研究則尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以切花市場(chǎng)的常見(jiàn)百合品種‘黃天霸’為材料，克隆了LbKCS5和LbKCS17，對(duì)其蛋白特性進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)這2個(gè)基因在百合不同器官、花蕾不同發(fā)育時(shí)期、低溫和失水脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了分析，為探究LbKCS5和LbKCS17基因在百合發(fā)育和非生物脅迫中的作用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

實(shí)驗(yàn)材料為多頭百合‘黃天霸’，切花與種球購(gòu)于斗南花卉市場(chǎng)(中國(guó)昆明)，昆明理工大學(xué)農(nóng)工樓實(shí)驗(yàn)室室溫培養(yǎng)。

1)花蕾發(fā)育4個(gè)時(shí)期(圖1)，綠蕾期(花蕾全為綠色，緊實(shí))、黃蕾期(花蕾變成黃色，蓬松未開(kāi)放)、盛花期(花瓣完全展開(kāi)，顏色最鮮艷)和衰敗期(花瓣開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫)，取花瓣(最外層花瓣)、葉(花下第一片葉)為材料，分析花蕾不同發(fā)育時(shí)期花瓣和葉中的基因表達(dá)。2)盛花期花瓣(最外層花瓣)、葉片(花下第一片葉)、根、鱗莖(最外層鱗片)、花藥、雌蕊和雄蕊(圖2)為材料進(jìn)行基因表達(dá)研究。3)由于切花百合主要在綠蕾期進(jìn)行采收，在運(yùn)輸過(guò)程中容易受到失水及低溫脅迫，故以綠蕾期的花為材料進(jìn)行脅迫處理[11-12]。失水脅迫處理：將綠蕾期的切花，修剪花莖長(zhǎng)度為5 cm用蒸餾水洗凈擦干插入空瓶，對(duì)照組插入蒸餾水中，然后將材料放入光照培養(yǎng)箱中，23 ℃、14 h光照/21 ℃、10 h黑暗處理，光通量密度 400 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度55%；低溫脅迫處理：將綠蕾期的切花，修剪花莖長(zhǎng)度為5 cm，插入蒸餾水，放入光照培養(yǎng)箱中低溫(4 ℃)處理14 h光照/10 h黑暗，光通量密度 400 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度55%。分別在處理 0、3、6、9、12、24 h時(shí)取材。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄使用Trizol法提取，參照尹慧等[13]和遲博文等[14]的方法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄使用賽默飛世爾公司(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)試劑盒，嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈分裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA克隆根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到LbKCS5和LbKCS17同源cDNA序列采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，試劑盒參照寶生物公司Taq酶(TaKaRa TaqTM)，PCR反應(yīng)程序：變性98 ℃10 s，退火30 s(LbKCS5和LbKCS17退火溫度分別為50.6 ℃，51.7 ℃)，延伸72 ℃ 1 min/1 000 bp，35個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，得到明亮的條帶且位置大小準(zhǔn)確則送生物公司測(cè)序。

表1 基因克隆和qRT-PCR引物

1.2.3LbKCS5和LbKCS17基因的生物信息學(xué)分析用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析[15]，在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，EXPASY(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html6.)計(jì)算等電點(diǎn)(pI)和分子量(Mw)，PSORT(http://psort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行蛋白的基序分析[16]。

1.2.4LbKCS5和LbKCS17基因表達(dá)特異性分析根據(jù)LbKCS5和LbKCS17同源cDNA序列采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因特異性引物，引物序列見(jiàn)表1，內(nèi)參基因?yàn)閍ctin(JX826390)。根據(jù)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，使用Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)

試劑盒參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)體系：Hieff?qPCRSYBR?Green Master Mix:10 μL，正反引物各0.4 μL，模板DNA 2 μL，無(wú)菌超純水 7.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。利用Excel 2010計(jì)算表達(dá)量，SPSS 18.0進(jìn)行方差分析，Sigmaplot12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LbKCS5和LbKCS17基因克隆

以‘黃天霸’綠蕾期的花cDNA為模板，對(duì)LbKCS5和LbKCS17進(jìn)行特異性引物擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度分別約為700和1 200 bp的2條片段(圖3)，經(jīng)測(cè)序分析，LbKCS5和LbKCS17的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為689和1 228 bp。

利用Prot Param軟件分析，經(jīng)開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)分析，LbKCS5基因長(zhǎng)度為689 bp，編碼186個(gè)氨基酸殘基；LbKCS17長(zhǎng)度為1 238 bp，編碼291個(gè)氨基酸殘基；LbKCS5和LbKCS17蛋白相對(duì)分子量分別為21.297kD和32.908 kD，理論等電點(diǎn)分別為9.37和9.28。

2.2 亞細(xì)胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)這2個(gè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)LbKCS5和LbKCS17最有可能定位在細(xì)胞質(zhì)。通過(guò)在線工具TMHMM-2.0對(duì)LbKCS5和LbKCS17蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明LbKCS5蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，其中1～14位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，15～34、166～185位氨基酸之間形成2個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)；而LbKCS17蛋白預(yù)測(cè)為不含跨膜螺旋區(qū)。

2.3 LbKCS5和LbKCS17基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用SOPMA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明LbKCS5蛋白的α螺旋占氨基酸殘基總數(shù)的67%、LbKCS17占43.64%；β-轉(zhuǎn)角在LbKCS5蛋白中占氨基酸殘基總數(shù)的6.53%、LbKCS17中占6.53%；無(wú)規(guī)則卷曲在LbKCS5中占6%、LbKCS17中占35.05%；延伸鏈在LbKCS5中占18%，LbKCS17中占14.78%。通過(guò)在線工具M(jìn)ODELING進(jìn)行三級(jí)建模，結(jié)果顯示LbKCS5和LbKCS17蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致。

2.4 LbKCS5和LbKCS17的氨基酸序列及基序分析

使用在線軟件MEME進(jìn)行蛋白motif分析(圖4，Ⅰ-A)發(fā)現(xiàn)，LbKCS5蛋白與4種植物的motif位置前后較相近，其中包含3個(gè)相似motif；圖4，Ⅰ-B中字母高低代表氨基酸序列的出現(xiàn)頻率大小，motif 1和motif 2、motif 3的氨基酸序列相比存在大約69%和73%、87%的差異，推測(cè)motif 1在5種植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到了關(guān)鍵的生物學(xué)作用。圖4，Ⅱ-A中，LbKCS17蛋白與菠蘿的motif 位置大小最相近，與木樨欖、野大豆較為相近，motif 1、2、3、4(圖4，Ⅱ-B)的氨基酸序列相比存在30%、47%、48%、63%的差異。結(jié)果表明，motif 1在5種植物生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用。

2.5 LbKCS5和LbKCS17的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)Blast序列比對(duì)(圖5，Ⅰ)發(fā)現(xiàn)，LbKCS5與油棕(Elaeisguineensis)、海棗(Phoenixdactylifera)序列相似性最高，分別為82.61%和81.37%，與亞麻薺(Camelinasativa)等植物相似性為77%～80%；LbKCS17(圖5，Ⅱ)與蓮(Nelumbonucifera)相似性最高，為77.62%，與番茄(Solanumlycopersicum)等相似性為75%～77%。利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析(圖5，Ⅰ)，LbKCS5在2～36、51～132個(gè)氨基酸處含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為IPR013601：FAE1 typ3 polyketide synth(FAE1/Ⅲ型聚酮合酶)、IPR013747: ACP syn Ⅲ C(3-氧代?；?酰基載體蛋白合酶)；LbKCS17(圖5，Ⅱ)在1～160和177～257個(gè)氨基酸處有2個(gè)成分復(fù)雜度較低的保守結(jié)構(gòu)域，分別為IPR013601：FAE1 typ3 polyketide synth(FAE1/Ⅲ型聚酮合酶)、IPR013747: ACP syn Ⅲ C(3-氧代?；??；d體蛋白合酶)，說(shuō)明這些保守結(jié)構(gòu)域在不同物種存在著相似的生物學(xué)功能。

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6，Ⅰ)分析發(fā)現(xiàn)，LbKCS5與山藥(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)、海棗(Phoenixdactylifera)、姜(Zingiberofficinale)進(jìn)化水平較接近且在同一分支中，與亞麻薺、煙草(Nicotianaattenuata)進(jìn)化水平較遠(yuǎn)。如圖6，Ⅱ所示，LbKCS17與菠蘿、蓮、油棕進(jìn)化水平較接近且在同一分支，與番茄、中華辣椒(Capsicumchinense)等茄科植物進(jìn)化水平較遠(yuǎn)。

2.6 LbKCS5和LbKCS17基因在百合器官中的表達(dá)

如圖7所示，在‘黃天霸’營(yíng)養(yǎng)器官中，LbKCS5的表達(dá)量以根中最低，葉中最高；在花器官中LbKCS5的表達(dá)量依此為雄蕊>雌蕊>花藥>花瓣；LbKCS17表達(dá)量也是在根中最低，葉中最高；在花器官中的表達(dá)則是在花藥中最高，雄蕊次之，花瓣中最低。

2個(gè)基因在花蕾發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)如圖8所示，LbKCS5在花瓣和葉中的表達(dá)均先增加后下降，在黃蕾期達(dá)到最大值(圖8，A)。LbKCS17在花蕾生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，在花瓣中的表達(dá)先升高后降低，在黃蕾期和盛花期表達(dá)最高；在葉中其表達(dá)相對(duì)較低，也是在黃蕾期表達(dá)量達(dá)到峰值(圖8，B)。

2.7 不同脅迫下LbKCS5和LbKCS17基因的表達(dá)

如圖9所示，失水脅迫能誘導(dǎo)LbKCS5和LbKCS17表達(dá)量升高。其中，LbKCS5在失水脅迫處理6 h高于對(duì)照(圖9，A)，在9 h與對(duì)照差異顯著，12 h達(dá)到峰值；LbKCS17則在處理3 h高于對(duì)照，在6 h時(shí)與對(duì)照差異顯著，到24 h時(shí)其表達(dá)量仍在增加且與對(duì)照差異顯著(圖9，B)。

圖10顯示低溫處理下2個(gè)基因的表達(dá)。LbKCS5在12 h前低于對(duì)照，在12 h時(shí)達(dá)到最高峰并且顯著高于對(duì)照(圖10，A)；但低溫未能誘導(dǎo)LbKCS17的表達(dá)增加，與對(duì)照相比反而降低了其表達(dá)量(圖10，B)。

3 討 論

植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面的一類不溶于水而易溶于有機(jī)試劑的物質(zhì)。VLCFA是蠟質(zhì)合成的重要前體，KCS是植物合成VLCFAs的關(guān)鍵限速酶，該酶催化 C2單元從丙二酰-CoA 縮合為?；?CoA，決定了VLCFAs的合成速率和碳鏈長(zhǎng)度[17]。

研究表明，在百合營(yíng)養(yǎng)器官中LbKCS5和LbKCS17均有表達(dá)，這2個(gè)基因在葉中表達(dá)量最高，而在根中最少；在擬南芥中發(fā)現(xiàn)KCS4 主要在芽和根頂端分生組織、葉脈、成熟和發(fā)芽的花粉粒以及發(fā)育中的胚中表達(dá)[17]，KCS10 在植株地上部分表達(dá)，而在根中為最少[18]。KCS在蒺藜苜蓿葉、花器官和莖頂端分生組織，但在根中表達(dá)水平較低[19]；Pruitt 使用原位 RNA 雜交技術(shù)分析表明KCS10 基因定位于擬南芥的莖、葉和花瓣等表皮細(xì)胞，但在根中幾乎無(wú)信號(hào)[20]。此外，在大麥中的研究也暗示，KCS基因表現(xiàn)出不同的組織表達(dá)模式[21]。

本研究在花器官中的表達(dá)結(jié)果顯示，在雄蕊中LbKCS5的表達(dá)量最高，LbKCS17則在花藥中最高，在花瓣中二者的表達(dá)量最低。臍橙中CsKCS6在所有組織中均有表達(dá)，在柱頭中檢測(cè)到最高表達(dá)[22]；Yang等[23]研究表明，在柑桔中CsKCS2和CsKCS11主要在果實(shí)的外皮表達(dá)，且它們的表達(dá)隨著成熟而急劇增加。在百合花蕾生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，本研究結(jié)果表明花瓣和葉中2個(gè)基因的表達(dá)均先升高后下降，花瓣中2個(gè)基因的表達(dá)在黃蕾期達(dá)到峰值，在黃蕾期的葉中LbKCS5表達(dá)量最高。此外，Cheng等[24]在百合的綠蕾期和盛花期對(duì)花瓣中蠟質(zhì)種類和含量檢測(cè)結(jié)果表明，隨著花的發(fā)育花瓣中蠟質(zhì)種類增加，蠟質(zhì)含量升高，結(jié)合本研究中LbKCS5和LbKCS17基因在百合不同器官及花蕾不同發(fā)育階段中的表達(dá)變化，因此推測(cè)LbKCS5和LbKCS17可能參與百合表皮蠟質(zhì)的生物合成。

植物表皮蠟質(zhì)作為植物和環(huán)境間的第一道屏障，對(duì)植物體內(nèi)水分的維持有重要意義。作為蠟質(zhì)脂肪酸合成通路中的限速酶，故推測(cè)當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，KCS有可能會(huì)做出相應(yīng)應(yīng)答。在蘋果果皮中發(fā)現(xiàn)8個(gè)MdKCS基因在干旱、脫落酸 (ABA) 和 NaCl 處理下被顯著誘導(dǎo)表達(dá)[25]；此外，Guo等[22]在臍橙中也發(fā)現(xiàn)CsKCS6的轉(zhuǎn)錄因干旱脅迫、鹽脅迫和脫落酸(ABA)處理發(fā)生了變化，在擬南芥中過(guò)表達(dá)該基因則提高了轉(zhuǎn)基因植株抗非生物脅迫的能力。本研究中，失水和低溫處理均能誘導(dǎo)切花百合中LbKCS5的表達(dá)；失水脅迫提高了LbKCS17的表達(dá)量，但低溫卻降低了其表達(dá)量，且LbKCS17對(duì)失水脅迫響應(yīng)更敏感。由此可見(jiàn)，LbKCS5和LbKCS17對(duì)這兩種非生物脅迫有響應(yīng)，這也為將來(lái)提高百合耐失水、低溫的脅迫能力提供了可行途徑和理論支持。

本研究通過(guò)克隆百合切花蠟質(zhì)合成的關(guān)鍵基因LbKCS5和LbKCS17，分析了他們?cè)诎俸喜煌鞴?、花發(fā)育不同階段的表達(dá)模式以及在失水和低溫脅迫下的表達(dá)，為通過(guò)調(diào)控百合切花中LbKCS5和LbKCS17的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控百合切花中蠟質(zhì)含量，提高切花在采后和長(zhǎng)距離運(yùn)輸中的耐失水和低溫脅迫能力，避免因脅迫導(dǎo)致的花蕾畸形、早衰，最終延長(zhǎng)切花的瓶插期，提高切花的質(zhì)量提供了可能。