文│王林浩 丁樹(shù)龍 陳鼎 藺凡 羅瑤瑤 劉金平（青島易邦生物工程有限公司）

在生豬養(yǎng)殖中很容易感染豬細(xì)小病毒（PPV），導(dǎo)致妊娠期母豬流產(chǎn)、死胎、畸形胎等，還可能致使母豬不孕，仔豬出現(xiàn)皮膚炎癥與腹瀉等情況。此類(lèi)病毒在全世界豬群內(nèi)傳播，威脅著整個(gè)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)PPV后，許多國(guó)家陸續(xù)檢測(cè)到其抗體與病毒，并開(kāi)始研究滅活疫苗。本試驗(yàn)以PPV HN-4株為例，根據(jù)其生物學(xué)特性，針對(duì)不同佐劑對(duì)PPV滅活疫苗在豬體中的免疫效果進(jìn)行對(duì)比分析，為臨床PPV預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

一、試驗(yàn)材料與方法

1.材料與設(shè)備。

試驗(yàn)材料：PPV油乳佐劑疫苗、PPV鋁膠佐劑疫苗、納米鋁膠佐劑疫苗、市場(chǎng)銷(xiāo)售的油乳劑疫苗與PPV蜂膠疫苗；所用動(dòng)物為出生一個(gè)月的斷奶仔豬，數(shù)量為24頭，經(jīng)過(guò)HI和ELISA檢驗(yàn)后，PPV抗體呈陰性。

儀器設(shè)備：源于蘇靜集團(tuán)的超凈工作臺(tái)；源于上海寶峰集團(tuán)的全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，型號(hào)為T(mén)hermo Fisher Scientific；源于欣康醫(yī)療器械公司的微量96孔血凝板；源于美國(guó)的型號(hào)為Accuri C6流式細(xì)胞儀；源于BioXL公司的ELISA試劑盒；源于日本Sanyo的二氧化碳培養(yǎng)箱。

2.操作方法。將試驗(yàn)所用的24頭仔豬隨機(jī)分成6組，每組4頭。A組注射PPV油乳佐劑疫苗，每頭2毫升；B組注射PPV鋁膠佐劑疫苗，每頭2毫升；C組注射納米鋁膠佐劑疫苗；D組注射市場(chǎng)銷(xiāo)售的油乳劑疫苗；E組注射PPV蜂膠疫苗，每頭2毫升；F組注射生理鹽水，每頭2毫升。上述各組均采用頸部肌肉免疫方式，在間隔14天后以相同劑量再次免疫。

3.測(cè)定方法。

（1）抗體水平檢測(cè)。在接種0～6周之內(nèi)，每周隨機(jī)選取3頭豬，對(duì)其前腔靜脈位置采集血液樣本，將血清分離后備用；將分離后的血清放入溫度為56℃的環(huán)境下，水浴0.5小時(shí)，通過(guò)酸性為25%高嶺土處理后，再用HI檢驗(yàn)其抗體水平，生成抗體動(dòng)態(tài)規(guī)律曲線；根據(jù)ELISA試劑盒的操作流程進(jìn)行檢測(cè)，借助ELISA原理對(duì)PPV抗體進(jìn)行檢驗(yàn)；抗體效價(jià)以標(biāo)記酶的OD630指標(biāo)為衡量標(biāo)準(zhǔn)，如若結(jié)果超過(guò)0.4，則為“陽(yáng)性”；如若在0.2～0.4范圍內(nèi)則為“可疑”，如若結(jié)果低于0.2則為“陰性”。

（2）T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)。在接種0～6周之內(nèi)，每周隨機(jī)選取3頭豬，對(duì)其前腔靜脈位置采集血液樣本，檸檬酸鈉抗凝，分離淋巴細(xì)胞，利用PBS溶液控制細(xì)胞數(shù)量，將其提升到5.0×106/毫升，再利用流式細(xì)胞儀對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢驗(yàn)。

（3）血清抗體效價(jià)測(cè)定。在免疫接種3周后，隨機(jī)選取3頭豬進(jìn)行靜脈采血，血清分離后，放入溫度為-20℃的冰箱內(nèi)保存，以備檢測(cè)。按照MEM培養(yǎng)液體積1%接種PPV疫苗，放入96孔板內(nèi)，每個(gè)孔為100微升，在溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入冷卻后的乙醇，100微升孔固定，風(fēng)干后，再加入5%脫脂乳到孔中，密封30分鐘，用PBST洗滌3次。將事先準(zhǔn)備好的血清用PBS稀釋?zhuān)賹?00微升孔加入到96孔板內(nèi)，在溫度為37℃的搖床內(nèi)孵育60分鐘，利用PBSH洗滌3次后，將96孔板放入熒光顯微鏡下觀察可得。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。利用Excel和SPSS12.5軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，得出各項(xiàng)指標(biāo)均值，以Means±SD形式表示，再用SPSS軟件實(shí)施Dun can’s深層分析。

二、試驗(yàn)結(jié)果

1.免疫豬血清HI檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)HI試驗(yàn)結(jié)果可知，不同組別的樣本在接種后均會(huì)對(duì)豬體產(chǎn)生刺激，進(jìn)而形成HI抗體，且抗體水平與免疫時(shí)長(zhǎng)具有正相關(guān)關(guān)系，在接種后第一周，C組抗體水平明顯超過(guò)B組；在接種第3周后，C組抗體水平達(dá)到最高值，與A組相比提前14天，與B組相比提前7天；A組抗體峰值相對(duì)最高，為11.58log2，C組次之，為11.24log2，B組排名第三，為10.95log2；以上三種疫苗在抗體峰值方面均超過(guò)D組與E組。在抗體水平方面，接種后第6周C組的抗體滴度達(dá)到9.72log2，A組為11.45log2，B組為9.87log2，這意味著B(niǎo)組的抗體滴度流失相對(duì)較快，A組相對(duì)較慢。

2.豬血清內(nèi)抗體水平。經(jīng)過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)后，對(duì)不同時(shí)段收集到的血清抗體樣本進(jìn)行匯總，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，不同組別樣本在接種疫苗后均會(huì)使豬體受到刺激，形成抗PPV抗體，但在抗體水平、峰值時(shí)間方面有所區(qū)別。在接種后第二周，C組抗體水平超過(guò)B組；在接種第3周后，C組的抗體水平達(dá)到最大值，與A組相比提前7天；在接種第4周后，A組的抗體水平提高到最大，且與剩余組別間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；在抗體峰值方面，A組為最高，OD630值為0.624，C組次之，為0.431，B組排名第三，為0.264。

3.外周血內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群變化。根據(jù)圖1可知，在接種完畢后，各組樣本的外周血T淋巴細(xì)胞亞群均發(fā)生改變，且數(shù)量與原本相比都有一定程度的提升，C組領(lǐng)先，與F組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；各組間差異不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

三、討論

1.HI檢測(cè)后豬抗體水平分析。血凝試驗(yàn)在PPV檢測(cè)中的意義重大，該試驗(yàn)的操作便捷、經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)，但對(duì)試劑配置要求較高，試劑準(zhǔn)確度、判定時(shí)間、豚鼠紅細(xì)胞配置濃度等都會(huì)影響試驗(yàn)成敗。在試驗(yàn)期間，為了確保準(zhǔn)確性與特異性不受影響，可用酸性高嶺土對(duì)準(zhǔn)備檢測(cè)的血清進(jìn)行處理，將內(nèi)部非特異性血凝制物去除。根據(jù)研究結(jié)果可知，A組、B組和C組在接種后均會(huì)形成較高抗體滴度。三者中的C組抗體峰值出現(xiàn)時(shí)間較早，在接種后第三周便可達(dá)到最大值，與B組相比提前7天，與A組相比提前14天，且C組抗體水平在接種后首周明顯超過(guò)B組，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，但C組抗體滴度消耗相對(duì)較快，在三種疫苗中，A組抗體峰值水平為最高。

2.ELISA檢測(cè)抗體水平分析。針對(duì)每周采集到的血清樣本利用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在接種后不同組別樣本在接種疫苗后均會(huì)使豬體受到刺激，形成抗PPV抗體，但在抗體水平、峰值時(shí)間方面有所區(qū)別。在接種后第二周，C組抗體水平超過(guò)B組；在接種第3周后，C組的抗體水平達(dá)到最大值，與A組相比提前7天；在接種第4周后，A組的抗體水平提高到最大，與剩余組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。對(duì)于上述兩種抗體檢測(cè)方式來(lái)說(shuō)，在抗體消長(zhǎng)規(guī)律方面基本相同，根據(jù)結(jié)果可知，三種佐劑疫苗中的C組抗體產(chǎn)生時(shí)間、峰值產(chǎn)生事件均相對(duì)較早，但抗體消降速度也較快，A組雖然抗體產(chǎn)生時(shí)間較晚，但消降速度較慢，持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。本研究對(duì)納米佐劑能夠提前誘導(dǎo)PPV的抗體應(yīng)答進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與前人研究基本相同，說(shuō)明納米佐劑之所以能夠促進(jìn)豬抗體應(yīng)答提高，可能受納米佐劑中的載體結(jié)構(gòu)特性影響。

◎圖1 免疫后豬外周血內(nèi)T淋巴細(xì)胞占比情況

3.疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。該試驗(yàn)對(duì)豬體外周血內(nèi)的T淋巴細(xì)胞群進(jìn)行檢驗(yàn)，通過(guò)流式細(xì)胞儀完成，對(duì)多種佐劑疫苗接種后的細(xì)胞應(yīng)答情況進(jìn)行研究。根據(jù)研究結(jié)果可知，各組疫苗均可對(duì)豬體產(chǎn)生刺激，激發(fā)細(xì)胞免疫力，但不同組別之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。與B組相比，C組T淋巴細(xì)胞亞群的占比相對(duì)較高，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，這說(shuō)明三種疫苗均可對(duì)豬體細(xì)胞免疫起到一定強(qiáng)化功效。該試驗(yàn)制備的三種PPV疫苗在經(jīng)過(guò)接種后，利用HI檢測(cè)與ELISA檢測(cè)后，均說(shuō)明該疫苗可對(duì)豬體特異性產(chǎn)生促進(jìn)作用，借助流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群變動(dòng)情況進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)研究結(jié)果可知，PPV疫苗均可促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫功能提升，說(shuō)明具有較強(qiáng)的免疫原性、反應(yīng)原性，為PPV疫苗研發(fā)與推廣應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。