顏朦朦，李慧冬，張文君，陳子雷，郭長英，朱 超,*，佘永新

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，山東 濟南 250100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

天然或合成農(nóng)藥主要用于預(yù)防、消除或控制作物疾病、害蟲和雜草等。然而，只有不足1%的農(nóng)藥真正發(fā)揮了作用，剩余部分進入環(huán)境，并在食物鏈中大量累積和持久殘留，進而對人體健康造成影響，如致癌性、遺傳毒性和免疫毒性等。因此，農(nóng)藥的監(jiān)管、監(jiān)測非常重要。

自20世紀(jì)70年代以來，質(zhì)譜法和色譜法（又稱確證方法）被視為農(nóng)藥殘留檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測靈敏度高、準(zhǔn)確性好、精密度高的優(yōu)點，然而，這些方法所需設(shè)備價格昂貴、檢測費用高、需專業(yè)人員操作，僅適用于實驗室檢測，不能滿足現(xiàn)場檢測、進出口口岸及超標(biāo)事件應(yīng)急處理的迫切要求。近年來，對農(nóng)藥殘留快檢方法的研究得到越來越多的關(guān)注，如電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器（熒光、量子點、表面等離子體共振等）、表面增強拉曼光譜（surface enhancement Raman spectroscopy，SERS）技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、酶聯(lián)免疫吸附測定法等，這些方法具有儀器可小型化、可用于現(xiàn)場檢測、檢測成本低、準(zhǔn)確性高、檢測速度快等優(yōu)點，是確證方法的有效補充。

其中，SERS技術(shù)因具有檢測速度快、特異性強（可提供目標(biāo)物指紋信息）、靈敏度高、可實現(xiàn)多殘留檢測等特點，已被廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。SERS技術(shù)是一種超靈敏振動光譜技術(shù)，用于檢測貴金屬（金（Au）或銀（Ag））納米結(jié)構(gòu)（通常稱為增強基底）表面或表面附近的分子，可將分子原有但微弱的拉曼信號增強至幾個數(shù)量級（通常為10～10），甚至可達到單分子檢測水平，另外，便攜式拉曼儀的快速發(fā)展更加滿足了快檢的需求。

現(xiàn)階段，SERS應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測主要有兩種模式：直接檢測（無標(biāo)記）和間接檢測（有標(biāo)記）。直接檢測，是增強基底對農(nóng)藥分子直接產(chǎn)生增強作用，利用信息豐富的指紋圖譜，達到定性定量的目的，具備分析速度快、特異性強等優(yōu)點。直接檢測技術(shù)在農(nóng)藥殘留快速檢測方面取得了一定研究成果，但現(xiàn)已報道的方法中，仍存在較多問題：其檢測靈敏度低，不能滿足國家規(guī)定的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)；SERS對具有類似結(jié)構(gòu)性質(zhì)和拉曼活性的同系物選擇性較差，難以實現(xiàn)農(nóng)藥多殘留同步分析；農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)的SERS信號易與農(nóng)藥分子的SERS圖譜重合，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重；且一些農(nóng)藥因結(jié)構(gòu)問題難以通過直接檢測將其識別。因此，僅依靠開發(fā)新型高增強因子（enhancement factor，EF）的增強基底已不能滿足所有農(nóng)藥檢測的需求。研究和開發(fā)新的SERS檢測方法將是一個新的突破點。

SERS間接檢測技術(shù)又稱SERS標(biāo)記技術(shù)，其原理是將貴金屬納米粒子與強拉曼散射分子（拉曼報告分子（Raman reporters，RRs））組成SERS標(biāo)簽，其簡易制備過程如圖1所示，此類SERS標(biāo)簽具有類似于熒光團的光學(xué)標(biāo)記功能，具有較高靈敏度、較好的分子指紋保真度、強抗光漂白性、圖譜范圍窄（比熒光窄1/10～1/100）、可多路復(fù)用等性能，已成為化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)檢測的優(yōu)良標(biāo)記物。SERS標(biāo)簽可以進一步結(jié)合識別分子（如抗體、適配體、分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）等），組成基于SERS標(biāo)記技術(shù)的生物傳感器，在目標(biāo)物不具有SERS信號的情況下，對目標(biāo)物進行定性定量檢測。目前SERS標(biāo)記技術(shù)已用于多種危害因子檢測，實現(xiàn)了納米技術(shù)、生物分析技術(shù)、生物傳感的有機結(jié)合。近年來，這項技術(shù)也逐漸應(yīng)用到農(nóng)藥殘留領(lǐng)域，有效解決了SERS技術(shù)用于農(nóng)藥殘留檢測的部分難題，并取得了突破性成果。然而，目前鮮見綜述對基于SERS標(biāo)記技術(shù)的生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展進行全面地總結(jié)。因此對其進行概括總結(jié)對于將基于SERS標(biāo)記技術(shù)的生物傳感器更廣泛地應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測，甚至食品安全檢測領(lǐng)域具有重要意義。

圖1 SERS標(biāo)簽的制備Fig. 1 Preparation of SERS tags

本綜述系統(tǒng)總結(jié)近年來SERS標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的研究進展，首先介紹SERS標(biāo)簽的設(shè)計及制備方法；然后根據(jù)不同的識別元件（抗體、適配體、MIPs等），介紹SERS標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測方面的應(yīng)用情況；最后總結(jié)SERS標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測方面的未來發(fā)展前景及挑戰(zhàn)。

1 SERS標(biāo)簽的設(shè)計及制備

1.1 SERS增強基底

在SERS標(biāo)記方法中，SERS標(biāo)簽對于傳感器的檢測性能起著至關(guān)重要的作用。典型的SERS標(biāo)簽由兩個重要部分組成：金屬納米顆粒（SERS增強基底）和RRs。其中，SERS增強基底用于增強RRs的拉曼信號。金納米顆粒（Au nanoparticles，Au NPs）或銀納米顆粒（Ag nanoparticles，Ag NPs）是最常用的SERS增強基底，可對報告分子的拉曼信號進行顯著增強。Au NPs因制備簡單，是最常用的增強基底。納米粒子的形狀影響其光學(xué)特性，尤其是納米粒子的邊緣和尖角，可實現(xiàn)最高的近場增強，進而提高靈敏度。目前，已報道多種不同類型SERS增強基底，包括納米棒（nanorods，NRs）、金納米二聚體（Au nanodimers，Au-NDs）、納米星、納米棱鏡和納米球、納米三角形等。Au NRs是SERS增強基底的最佳備選材料之一，其邊緣有很強的SERS增強作用。納米星和納米花也是很好的備選材料，因為它們具有更大的比表面積，能夠使更多的RRs附著在其表面上。另外，納米星尖端的相互影響也可以進一步增強SERS信號。此外，因為雙金屬NPs之間的等離子體耦合可產(chǎn)生巨大的電磁增強，核心-殼型金屬納米顆粒也被廣泛用于制備SERS標(biāo)簽，如Au@Ag NPs、Au NRs@Ag、Au@Au-Ag NPs、Au@Pd@Pt NRs等。改善SERS增強的另一個重要方法是通過促進納米粒子的聚集來創(chuàng)建更多的“熱點”。這些增強基底都可以應(yīng)用于SERS標(biāo)簽的設(shè)計，并應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測中。

1.2 拉曼報告分子

RRs是SERS標(biāo)簽的信號源。常用的RRs通常包含巰基（-SH）或氨基（-NH）基團，例如孔雀石綠異硫氰酸酯（malachite green isothiocyanate，MGITC）、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5-dithio-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、4-氨基苯硫酚（4-aminophenylthiophenol，4-ATP）、4-巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）、4-巰基吡啶（4-mercaptopyridine，4-MPY）、羅丹明6G（rhodamine 6G，R6G）、4,4’-聯(lián)吡啶、2,2’-聯(lián)吡啶、4-氨基苯硫醇（4-aminobenzenethiol，4-ABT）、3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid）、4-甲基卞硫醇（4-methoxybenzyl mercaptan，4-MATT）、4-硝基硫酚（4-nitrothiophenol，4-NTP）等，這些RRs有如下共同特點：1）這些分子可以很容易且牢固地附著在金屬納米粒子表面；2）這些分子的散射截面高從而能夠獲得強拉曼信號。但現(xiàn)階段常用的RRs的SERS圖譜出現(xiàn)在600～1 800 cm范圍內(nèi)，常與基質(zhì)的SERS圖譜重合，抗基質(zhì)效應(yīng)性能差。近年來，一些具有炔烴、氰、疊氮化物等外源基團的化合物被應(yīng)用于構(gòu)建SERS標(biāo)簽，這些新型標(biāo)簽在1 800～2 800 cm的細(xì)胞拉曼沉默區(qū)表現(xiàn)出明顯的拉曼散射峰，可避免與生物基質(zhì)的SERS圖譜重合，進而避免背景信號干擾。且已成功應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測?？傊?，SERS標(biāo)簽設(shè)計的宗旨是保證高的靈敏度及化學(xué)和物理穩(wěn)定性。

2 SERS標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測

本部分從檢測原理、檢測效果等方面系統(tǒng)歸納近年來基于不同識別分子（抗體、適配體和MIPs）的SERS標(biāo)記技術(shù)用于農(nóng)藥殘留的檢測方法。不同識別分子的SERS標(biāo)記生物傳感器如表1所示。

表1 基于不同識別分子的SERS標(biāo)記生物傳感器應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測Table 1 SERS label-based biosensors with different recognition elements for pesticide residue detection

2.1 基于SERS標(biāo)記技術(shù)的免疫傳感器

抗原-抗體免疫反應(yīng)是生物傳感器最常用的識別機制，可提高SERS技術(shù)的選擇性和敏感性?？贵w是一種大分子質(zhì)量Y形蛋白，也稱為免疫球蛋白，它是通過在動物體內(nèi)免疫產(chǎn)生的，可對各種分析物（抗原）靶向特異性識別。農(nóng)藥分子一般是小分子，其免疫原性差，通常需要通過分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計和改造與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，再進行動物免疫，進而得到活性強的抗體。一般來講，抗體對農(nóng)藥分子只有一個識別位點，需要通過競爭法進行農(nóng)藥殘留的檢測。在此免疫反應(yīng)中主要包括3 個部分：SERS標(biāo)簽、競爭免疫基底和識別探針。基于以上機理，Li Xiaozhou等提出了一種基于SERS的免疫層析（immunochromatographic assay，ICA）方法，用于氯氰菊酯和高氰戊菊酯農(nóng)藥的雙重檢測，如圖2A所示，該學(xué)者以Au NPs為增強基底，以4-MBA、4-ATP為RRs，制備了SERS標(biāo)簽，然后再通過共價鍵作用，將抗體修飾在SERS標(biāo)簽的表面，形成識別探針；并將農(nóng)藥分子與雞卵清白蛋白的復(fù)合物固定在試紙條上，形成競爭基底物。不同的是，該試紙條具有兩條檢測線，由于兩個RRs的特征峰出現(xiàn)在不同位置，可用同一波長激光激發(fā)，進而進行多殘留檢測。此方法對氯氰菊酯和氰戊菊酯兩種農(nóng)藥殘留的檢測限分別為2.3×10ng/mL和2.6×10ng/mL，其靈敏度比酶聯(lián)免疫吸附試驗法和熒光ICA法高3～4 倍，且對于自來水、河水等實際樣品中兩種農(nóng)藥殘留的檢測具有良好的回收率。為了避免基質(zhì)效應(yīng)，Sun Yue等進行了以4-巰基苯甲腈（4-mercaptobenzonitrile，4-MBN）為RRs的SERS標(biāo)記免疫實驗，4-MBN的SERS特征峰出現(xiàn)在1 800～2 800 cm處，可以有效避開出現(xiàn)在低于1 800 cm處農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)的拉曼特征峰；該學(xué)者另以Au NRs@Ag為增強基底，制備SERS標(biāo)簽，在標(biāo)簽的表面修飾農(nóng)藥抗原分子，作為競爭基底物，在磁性納米粒子的表面修飾抗體，用以識別農(nóng)藥分子，通過競爭反應(yīng)，成功應(yīng)用于河水和蘋果汁中吡蟲啉的檢測，回收率在96.8%～100.5%之間（圖2B）。

抗體用于農(nóng)藥分子識別時也存在一些問題，如農(nóng)藥小分子結(jié)構(gòu)改造難度大，不易得到免疫原性高的抗原，進而難以得到有效抗體；另外抗體制備、純化過程非常復(fù)雜，生產(chǎn)成本高；制備出的抗體貯藏穩(wěn)定性受溫度、pH值、有機溶劑等條件影響大。因此，尋求其他特異性強的識別元件顯得尤為重要。納米抗體的研究可有效解決部分問題，若與SERS標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)能推進免疫傳感器的進一步發(fā)展。

2.2 基于SERS標(biāo)記技術(shù)的適配體傳感器

圖2 基于SERS標(biāo)記技術(shù)的免疫傳感器Fig. 2 SERS label-based immunosensors

適配體經(jīng)體外篩選得到，是長度一般在20～80 個核苷酸之間的單鏈寡核苷酸或者短的多肽。適配體和靶標(biāo)農(nóng)藥通過氫鍵、范德華力、疏水作用等作用力進行特異性識別與結(jié)合。在靶標(biāo)農(nóng)藥存在的情況下，適配體與靶分子相互作用，將自身折疊成各種三維結(jié)構(gòu)，包括G-四聯(lián)體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和T-結(jié)構(gòu)等。與抗體相比，適配體作為識別元件有以下幾個優(yōu)點：1）適配體的合成是在體外進行的，不需要動物實驗；2）由于小分子的低免疫原性，抗體通常需要在免疫前與載體蛋白結(jié)合以獲得有效抗體。而對于小分子的適配體可以從體外直接分離得到；3）由于分離適配體通常只需幾周時間，因此它可以很大程度上節(jié)省時間；4）與基于抗體的免疫分析方法相比，通過使用各種基于核酸的信號放大技術(shù)，可以進一步提高生物傳感器的檢測靈敏度；5）適配體還具有其他一些優(yōu)異的特性，如所能適應(yīng)的溫度和pH值范圍較寬、易于化學(xué)合成、批次間的差異性較小、易于修飾標(biāo)記分子等。適配體在生物傳感器的應(yīng)用有效增加了識別元件的種類。Sun Yue 等以適配體為識別元件，以Au NPs為增強基底，以4-(巰基甲基)苯甲腈（4-(mercaptomethyl) benzonitrile，MMBN）為RRs，制備了MMBN-Au NPs-適配體識別探針，然后在Ag NPs修飾的硅片上固定適配體識別鏈用作競爭基底物，通過競爭法實現(xiàn)了啶蟲脒的靈敏檢測，檢測限達到6.8 nmol/L，并成功應(yīng)用到蘋果汁中啶蟲脒的檢測，其檢測原理如圖3A所示。Wei Xiao’ou等同樣使用MMBN為RRs，以Ag NPs為SERS增強基底，制備MMBN-Au NPs-適配體識別探針，然后在FeO@Au核殼納米粒子上修飾適配體識別鏈用作競爭基底物，完成了櫻桃番茄和葡萄中阿特拉津的靈敏檢測，回收率在98.7%～106.6%之間（圖3B）。Lu Yuxiao等利用DNA可以形成四面體結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，構(gòu)建了多殘留SERS-適配體生物傳感器，如圖3C所示，四面體骨架的4 個角是由1 個Ag@Au NPs納米粒子及3 個修飾有不同RRs（4-ATP、4-NTP和4-MATT）的Ag@Au NPs納米粒子組成，其檢測原理如下：首先將3 種農(nóng)藥的適配體嵌入到DNA四面體骨架中的3 個邊緣，當(dāng)適配體識別農(nóng)藥分子時，隨著適配體結(jié)構(gòu)變化，DNA四面體也隨著變化，Ag@Au NPs納米粒子就會相互接近，形成SERS熱點，進而測得不同RRs的拉曼信號，實現(xiàn)農(nóng)藥分子的檢測，最終最低可檢測到0.002 1 ng/mL的丙溴磷、0.004 6 ng/mL的啶蟲脒以及0.006 1 ng/mL的多菌靈；通過實際樣品的添加回收試驗可知，該法與高效液相色譜-質(zhì)譜法具有較好的一致性。

適配體在農(nóng)藥分子檢測中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注，但是農(nóng)藥分子的適配體種類還是相對較少，急需篩選得到更多的適配體以供實際應(yīng)用，另外在基質(zhì)中適配體與靶標(biāo)分子的結(jié)合性能還需要進一步優(yōu)化。

2.3 基于SERS標(biāo)記技術(shù)的仿生免疫傳感器

圖3 基于SERS標(biāo)記技術(shù)的適體傳感器Fig. 3 SERS label-based aptasensors

MIPs仿生識別元件，屬于超分子研究領(lǐng)域，其制備過程如下：首先印跡分子（靶標(biāo)或靶標(biāo)分子類似物）與功能單體之間通過非共價鍵和/或共價鍵結(jié)合，形成主客體配合物；然后再加入交聯(lián)劑及引發(fā)劑，通過聚合反應(yīng)，形成高分子聚合物；最后通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⒂≯E分子洗脫或解離，形成具有識別印跡分子及靶標(biāo)分子結(jié)合空腔的聚合物。

MIPs因具有特異性高、易制備、成本低、化學(xué)及物理穩(wěn)定性好的優(yōu)點而常被用作前處理材料。與SERS技術(shù)結(jié)合時，通常將MIPs修飾在SERS增強基底的表面用于識別農(nóng)藥分子，起到聚集農(nóng)藥分子的作用，進而對農(nóng)藥分子進行SERS直接檢測，而與SERS標(biāo)記技術(shù)結(jié)合的研究較少。2019年，Yan Mengmeng等創(chuàng)建了仿生納米酶酶聯(lián)免疫吸附實驗（biomimetic nanozyme-linked immunosorbent assay，BNLISA）用于三唑磷SERS與比色雙模式檢測，首先合成三唑磷均勻MIPs微球，通過離子液體均勻的固定在96 孔陣列板上，形成識別元件。然后在三唑磷抗原分子上標(biāo)記納米酶，納米酶可以催化四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）為氧化TMB（TMB），TMB與SERS增強基底反應(yīng)后會產(chǎn)生很強的SERS信號，而且，其顏色變化可用肉眼觀察到。此方法屬于SERS間接標(biāo)記技術(shù)，可用SERS及比色雙模式檢測方法測定梨中三唑磷農(nóng)藥殘留，其檢測原理如圖4所示。

MIPs作為仿生識別分子已應(yīng)用多種有害因子的檢測，但仍存一些問題，如識別特異性有所欠缺，有些MIPs只能用于有機相識別目標(biāo)分子，另外，對農(nóng)藥分子的MIPs與SERS標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的研究仍較少。

圖4 BNLISA用于三唑磷SERS與比色雙模式檢測[54]Fig. 4 BNLISA for colorimetric and SERS sensing of triazophos[54]

3 結(jié) 語

本綜述總結(jié)了近年來SERS標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用情況，SERS標(biāo)記技術(shù)具有成本低、靈敏度高、多路復(fù)用性能好的特點，但是這些研究仍僅適用于實驗室，如將其工業(yè)化應(yīng)用，仍需要做出更多的努力。在此提出以下建議：1）為了保證SERS信號的靈敏度、穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，應(yīng)重點制備具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性強和均勻性高的SERS標(biāo)簽。其中，使用RRs內(nèi)標(biāo)校正SERS信號的波動是實現(xiàn)可靠定量SERS分析的有效方法。另外，SERS增強基底的穩(wěn)定性、均一性非常重要，近期，利用3D技術(shù)制備貴金屬納米粒子以改善粒子的均一性受到研究者的青睞。二維材料具有獨特的光學(xué)特性和較大的比表面積（可克服傳統(tǒng)貴金屬納米材料的缺點）也開始被應(yīng)用于SERS增強基底。2）食品基質(zhì)非常復(fù)雜，很容易干擾SERS標(biāo)簽的SERS信號，因此避免基質(zhì)效應(yīng)是保證方法準(zhǔn)確性的重要措施。為解決這一問題，有些研究人員在SERS標(biāo)簽的表面修飾一層保護層，如二氧化硅、二氧化鈦、脂質(zhì)體等，其中二氧化硅因具有化學(xué)惰性、機械穩(wěn)定性、表面易修飾等特點而成為最常用的保護層。核-殼型納米粒子也受到研究者的青睞，一般由兩種貴金屬組成，RRs存在于兩種貴金屬之間的縫隙中，其信號不僅可被增強，而且不易受外界環(huán)境的影響，但是外層的貴金屬層仍會增強非靶標(biāo)物質(zhì)信號，受基質(zhì)影響較大。另外，一些具有炔烴、氰、疊氮化物等外源基團的化合物作為RRs用于構(gòu)建SERS標(biāo)簽也有效解決了部分問題。同時，快速、效率高、通量高的前處理方法應(yīng)與生物傳感器相結(jié)合以消除部分基質(zhì)效應(yīng)。3）高通量、快速準(zhǔn)確是農(nóng)藥殘留檢測方法的發(fā)展趨勢，傳統(tǒng)RRs指紋圖譜復(fù)雜易重合，不利于多殘留方法的構(gòu)建，因此增加特征峰不易重合的外源化合物可用種類顯得非常重要。4）識別元件決定傳感器的特異性，但受環(huán)境影響較大，且現(xiàn)有的種類依然不能滿足靶標(biāo)多樣性的需求，應(yīng)提高識別元件的性能，并加強不同靶標(biāo)識別元件的研究。5）簡單、快速、低成本、可現(xiàn)場檢測及高通量檢測平臺應(yīng)與SERS標(biāo)記技術(shù)生物傳感相結(jié)合，如陣列試紙條、微流控芯片，陣列檢測板等，并配套開發(fā)可多通路同時檢測的便攜式拉曼光譜儀?？傊嘈烹S著研究的深入，SERS標(biāo)記技術(shù)將能夠更加有效地應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測，并拓展到食品安全檢測。